摘要：轮状病毒（RV）是引起婴儿腹泻的主要病原体之一，目前尚无有效药物治疗RV引起的婴儿腹泻。因此，新模型的开发对于RV诱导的婴儿腹泻的病理研究以及相关治疗策略的进展具有重要意义。本文首次介绍了RV- Wa株和RV-SA-11株可感染5 dpf和28 dpf仔鱼，以诱导与婴儿临床感染高度一致的婴儿腹泻模型。RV感染显著改变了仔鱼的体征、生存率和炎症反应。还分析了一些重要指标，包括RV抗原VP4和VP6的水平、体内RV跟踪和RV颗粒，这些指标共同证明成功建立了轮状病毒斑马鱼模型。更重要的是，我们还确定了拟议的RV感染斑马鱼模型用于抗病毒药物评估的潜力。总之，我们建立了一个RV感染斑马鱼模型，并制定了相关指标，可作为抗病毒药物筛选的高通量平台。

简介：婴儿腹泻是全世界五岁以下儿童死亡的第二大原因，每年造成约525000人死亡，特别是在发展中国家。婴儿腹泻是一种急性疾病，可导致呕吐、严重脱水和数天内死亡。婴儿腹泻的主要原因之一是RV。然而，到目前为止，RV引起的婴儿腹泻的发病机制尚不清楚，目前还没有有效的药物治疗该疾病。已经建立了几种模型来探讨其致病机制，包括MA104和Caco-2等细胞模型、小鼠、猪、猴、犬、牛、羊、兔等动物模型以及新建立的肠道类器官模型。细胞模型不能模拟疾病的过程，乳鼠模型由于母鼠的伤害和咬伤，幼鼠之间的均一性较差，因此不适合抗病毒药物筛选。无菌猪模型繁殖难度大，研究成本极高，严重制约了其广泛应用。模型的短缺严重阻碍了RV研究和相关药物开发的进程。因此，建立一种经济、实用、简便的RV新型动物模型，对于分析RV引起婴儿腹泻的病理机制和筛选抗RV药物具有重要意义。斑马鱼已迅速成为脊椎动物发育和基因功能研究的优良生物学模型，因为： (1) 斑马鱼卵在母体外受精和发育； (2) 基因操作简单； (3)后代数量多； (4) 繁殖周期短； (5) 胚胎是透明的，可以进行器官的活体成像； (6) 与人类基因同源性高。 已经在斑马鱼上开发了一系列针对人类疾病的病理模型，如败血症、癌症、肥胖症、糖尿病等。最近，斑马鱼在肠道炎症方面得到了广泛的研究。化学治疗如DSS、TNB、螺旋酮、非甾体抗炎药、脂质多糖或敲除一些炎症性肠炎样基因，如PIK3C3/vps34，可以创建斑马鱼肠道病理模型。已经建立了一系列感染斑马鱼的水产养殖相关病毒，如鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）、病毒性出血性脓毒症病毒（VHSV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、蛇头弹状病毒（SHRV）、神经坏死病毒（NNV）。同时，出现了人类易感病毒感染的斑马鱼模型，如单纯疱疹病毒-1（HSV-1）、基孔肯亚病毒（CHIKV）、甲型流感病毒（IAV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染的斑马鱼模型，这表明建立RV感染的斑马鱼模型对于进一步研究婴儿腹泻具有良好的前景。本研究首次成功鉴定RV-Wa和RV-SA-11可感染5dpf和28dpf仔鱼。仔鱼感染后体内可检测到RV抗原VP4和VP6，同时仔鱼形态、炎症因子mRNA表达、炎症相关细胞和肠道组织病理学发生明显改变。

图1、斑马鱼感染RV的实验程序。

感染情况筛查：5dpf仔鱼：用浸泡法感染仔鱼。我们调查了2:1、1:1和1:2的不同病毒感染率，以探索最佳感染率。感染SA-11和Wa株的5 dpf仔鱼的存活曲线如图2A所示。不同比例感染的仔鱼表现出不同程度的病变，如图2B所示。感染24 h后，将仔鱼安乐死并解剖肠道，随后用于检测VP6抗原。如图2C所示，感染比例为1:2的SA-11和Wa株生存率最高，感染的仔鱼表现出不同程度的病变，包括心包肿胀、皮肤粗糙、脊柱弯曲，甚至畸形。感染比例为2:1和1:1的SA-11和Wa病毒株生存率较低，大部分感染仔鱼死亡。同时，ELISA法结果表明，SA-11和Wa株的仔鱼体内均存在VP6抗原，感染比例为1:2。

图 2. 感染条件的筛选。 5 dpf仔鱼感染条件筛选结果如图A-C所示。（A：SA-11和Wa株感染5dpf仔鱼的存活曲线。B:5dpf仔鱼感染后的病变C：SA-11和Wa株1:2感染组5dpf仔鱼中抗原VP6的ELISA检测）。28 dpf仔鱼感染情况筛选结果见D-F。

28 dpf斑马鱼仔鱼：通过腹腔注射、灌胃和浸泡 RV 法研究了 28 dpf 仔鱼的感染。 根据28 dpf仔鱼的存活曲线，发现腹腔注射感染组和对照组的死亡率均较高。第一天，生存率降至50%左右，随后几天下降至20%。生存率迅速下降的原因可能是腹腔注射损伤了内脏器官，注射针直径过大造成的伤口难以恢复。从安全的角度来看，这种感染方式不利于模型的建立。 浸泡组生存率最高，达90%以上。同时，我们发现浸泡组的仔鱼出现腹泻。与正常组相比，感染组水质浑浊，粪便呈白色，呈细棒状或散成细颗粒状，松软柔软，部分鱼的肛门出现炎症。此外，ELISA方法的结果表明，浸泡组28 dpf仔鱼中存在抗原VP6。

90 dpf斑马鱼：我们还研究了腹腔注射、灌胃和RV浸泡对90 dpf斑马鱼的感染。SA-11病毒株感染的三种不同方式对90 dpf斑马鱼的生存率没有显著影响，感染后斑马鱼没有腹泻。摄食和行为能力与正常组无显著性差异。采用ELISA法检测90 dpf斑马鱼肠道中RV抗原VP6的表达，结果表明90 dpf斑马鱼肠道中没有RV抗原VP6。这些结果表明，90 dpf斑马鱼对RV SA-11株和Wa株不敏感，这可能与90dpf斑马鱼建立了抵抗病毒感染的适应性免疫系统有关。

5 dpf 斑马鱼仔鱼 RV 感染指标：活体成像：5 dpf 仔鱼感染荧光标记的 RV SYTO-SA-11 和 SYTO-Wa株。SYTO-SA-11感染4 h后，红色荧光逐渐在肠道内积聚。 感染6 h后，荧光在仔鱼肠道顶部和脑内积聚，10 h后在脑内逐渐增强。感染14 h后，肠内荧光逐渐减弱，脑内荧光持续增强。同样，感染4 h后在肠道和大脑中也观察到红色荧光SYTO-Wa感染的仔鱼，然后在感染10 h和12 h后主要转移并积聚到大脑中。

图3. A：红色荧光是用核酸染料标记的RV。 RV 首先在仔鱼的肠道中观察到。

抗原VP4检测：用ELISA法检测仔鱼RV的VP4抗原。 VP4抗原的标准曲线回归方程为：y = 0.0144x+ 0.116（R2=0.9921，表明在0.5 ng/L-18 ng/L范围内呈很好的线性关系。SA-11株或Wa株感染2天后，5dpf仔鱼肠道中RV抗原VP4的表达如图3B所示。结果表明，SA-11株感染组和Wa株感染组在感染24 h后病毒抗原VP4含量最高，分别为1.48 ng/L和2.16 ng/L。

qPCR：RV感染可导致促炎细胞因子（如IL-1β）的分泌和IL-6、IL-8和TNF-αmRNA表达水平的升高。据报道，随着疾病的进展，IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的表达水平增加。因此，我们可以利用qPCR检测感染后仔鱼体内炎症相关因子表达的变化，从而预测仔鱼感染情况。从麻醉下不同时间点的5dpf仔鱼中提取总RNA。检测各组TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的mRNA表达。 与正常组相比，SA-11感染组和Wa感染组TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表达均显著升高。

图4、A：炎症因子的表达。感染RV SA-11株和Wa株的5dpf仔鱼中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的相对表达。

中性粒细胞、巨噬细胞和凋亡细胞的观察：SA-11株和Wa株感染5dpf仔鱼24 h后，体内巨噬细胞和中性粒细胞的聚集情况如图5A和B所示。正常组的巨噬细胞和中性粒细胞主要集中在仔鱼的大脑和血液岛中。与正常组相比，SA-11株感染组和Wa株感染组巨噬细胞在肠道和肛门周围有明显聚集，感染组中性粒细胞在肠道周围有明显聚集。SA-11株和Wa株感染5dpf仔鱼24h后吖啶橙染色结果如图5C所示。与正常组相比，SA-11感染组和Wa感染组肠道周围可见明显的黄绿色荧光，提示细胞凋亡。

图5.化学染色条件。（A：中性红染色观察巨噬细胞。B：苏丹红B染色观察巨噬细胞。C：吖啶橙染色观察凋亡细胞。）

28dpf斑马鱼仔鱼RV感染指标：

28dpf仔鱼在感染RV SA-11株和Wa株24 h~72 h后出现不同程度的腹泻，如图6所示。与正常组相比，SA-11株感染组和Wa株感染组在感染24 h后均出现明显腹泻。感染SA-11毒株的仔鱼粪便较淡，呈白色或淡黄色，松散点状或絮状。感染Wa株后，粪便呈淡黄色、豆渣或蛋花，浑浊、不成形、质地柔软、易于触摸。这些感染仔鱼的腹泻可持续2-3天。

图6 A-C：正常组24、48、72 h的粪便； D-f：SA-11株感染组在24、48、72 h的粪便； G-I：Wa株感染组在24、48和72 h的粪便。

抗原VP4检测：LISA法检测仔鱼肠道RV的VP4抗原。 抗原VP4的标准曲线回归方程为：y = 0.0144x+ 0.116（R2=0.9921，在0.5 ng/L-18 ng/L范围内呈很好的线性关系。28dpf仔鱼中抗原VP4的表达如图7b所示。SA-11毒株感染组和Wa毒株感染组3天肠道内均检测到RV抗原VP4。 结果表明SA-11株感染组和Wa株感染组在感染24 h后病毒抗原VP4含量最高，分别为19.83 ng/L和21.98 ng/L。

图7.A：透射电镜观察28dpf仔鱼感染SA-11株和Wa株的肠道。7B:28dpf仔鱼中抗原VP4的表达。

RV感染仔鱼24小时后，HE染色观察肠石蜡切片的病理变化。 正常组绒毛非常发达，纵横交错或呈指状，结构致密清晰。单层柱状上皮细胞排列紧密，在绒毛表面成簇排列，绒毛与肠腔紧密相连。与正常组相比，SA-11株感染组肠绒毛不清晰且高度减少，有空泡化、上皮细胞不完整或脱落，Wa株感染组肠绒毛大部分不完整，腺细胞大部分脱落，上皮细胞排列不规则。

斑马鱼是应用最广泛的模式生物之一，具有体积小、易饲养、产卵量大、胚胎发育同步、胚胎易于观察、与人类基因同源性高等优点。基于斑马鱼模型超越乳鼠模型和无菌猪模型的优势，因此，本文RV感染斑马鱼模型显示了高通量和高抗RV药物筛选的潜力。

原文出自：Establishment of a rotavirus-infected zebrafish model and its application in drug screening - ScienceDirect