IVA型粘多糖病（MPSIVA）和Morquio A病是由N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶（GALNS）缺乏引起的，导致硫酸可拉坦（KS）和硫酸软骨素-6-积累。患者会出现严重的骨骼发育不良、早期软骨退化以及危及生命的心脏和气管并发症，但目前尚无治愈方法。 

基因治疗作为一种新兴的疗法，通过AAV等递送系统补偿突变基因的效价，在众多罕见病治疗上展现出巨大的应用潜力。Bertolin等人在MPSIVA疾病模型中注射AAV9-Galns，发现GALNS的活性能长期（1年）恢复，并且KS的表达水平恢复正常，从而改善MPSIVA的症状。这项研究证明AAV9-Galns基因治疗在治疗MPSIVA的应用潜力，为MPSIVA患者未来的临床治疗提供了强有力的理论基础。 

接下来我们就详细解读这篇文献，再深入理解基因治疗研究的常规套路吧。 

作者利用CRISPR/Cas9技术构建含有错义突变c.1156C>T的MPSIVA大鼠模型并且通过测序分析验证了该点突变，GALNS点突变的产生导致GALNS蛋白的功能发生突变（p.Arg386Cys）。研究人员将杂合子大鼠（GALN^+/−）与野生型大鼠（GALN^+/+）回交，以消除CRISPR/Cas9相关的脱靶效应（图1a-c）。对GALN敲除大鼠进一步分析，发现在这些大鼠所有的组织中均无法检测到GALNS活性水平，并且早在1个月大时，肝脏和血清中的KS含量一直很高，胫骨长度减少（图1d-g）。

图1.  MPSIVA大鼠疾病模型的构建。 

由于MPSIVA疾病的基因治疗面临的主要挑战是没有良好的递送系统，以增加局部GALNS的浓度。作者将AAV9-GFP注射至野生型雄性大鼠，通过观察荧光强度来评价AAV9递送系统的效率。在股骨、胫骨生长板（GP）和骨内膜周围的成骨细胞富集区、致密骨的内部细胞和关节软骨中检测到GFP阳性信号（图2a）。 

此外，在所有大鼠骨骼（股骨、胫骨、前肢骨、胸骨、肋骨和椎骨）和Morquio A大鼠的关键外周器官中也发现了高水平的GFP表达（图2b、c）。 

然后对MPSIVA大鼠注射AAV9-Galns，载体基因组拷贝数分析表明，AAV9-Galns在骨骼（图2d）和外周器官（图2e）中有较好的转导效率。表明AAV9在治疗MPSIVA上具有很大的应用潜力。

图2. AAV9在骨骼系统中具有良好的递送效果。

A. (I)致密骨(CB)； (II)生长板周围区域(GP)；(III)关节；(IV)骨小梁；(V)骨内膜。B. F，股骨；Ti，胫骨；R，肋骨；S，胸骨；V，椎骨；FL，前肢骨骼；K，膝盖骨；Fi，腓骨；Sc，肩胛骨；Hu，肱骨；T，气管；H，心脏；L，肝脏；A，附睾白色脂肪组织（eWAT）；Lu，肺；Q，股四头肌。 

身材矮小是MPSIVA患者的特点。MPSIVA雄性大鼠在第一个月龄期间显示出与WT大鼠相似的体重，但随后观察到体重和体型的显著下降（图3a、b）。并且MPSIVA大鼠的寿命也显著缩短，约30%的大鼠在2个月大时死亡（图3c）。 

经过AAV9-Galns基因治疗，MPSIVA大鼠的体重增加且存活率恢复正常（图3a-c），并且GALNS的活性和KS的水平恢复正常（图3d-f）。在肝脏和白色脂肪组织（WAT）中也发现GALNS活性较高（图3g、h）。GALNS活性提高使肝脏中KS含量正常化，仅储存在Kupffer细胞和WAT中（图3i-l）。此外，肝脏β-己糖胺酶（溶酶体内稳态生物标记物）活性恢复（图3m）。

图3. 注射AAV9-Galns能有效治疗MPSIVA。 

对MPSIVA大鼠使用AAV9-Galns，可增加Galns在骨骼中的表达，如股骨、胫骨和肱骨（图4a），可以降低GP和骨干中的KS累积（图4b-d）。 

2个月大的MPSIVA大鼠的GP软骨切片显示GP面积和钙化区均显著减少，表明随着大鼠年龄的增长，骨化发生了变化（图4e）。对MPSIVA大鼠胫骨GP的分析显示，静止区和增殖区的软骨细胞肥大，AAV9-Galns处理的MPSIVA大鼠的软骨细胞肥大明显减少（图4f）。 

透射电子显微镜（TEM）进一步证实了这一点，证明接受治疗的动物增殖软骨细胞中的储存液泡大量减少（图4g）。这些结果与AAV9-Galns基因治疗的MPSIVA大鼠中观察到的体型正常化一致（图3a、b）。 

经MPSIVA治疗的大鼠显示正常的骨密度和含量，以及小梁厚度、数量和间距。相反，未经治疗的MPSIVA大鼠的所有骨参数均发生改变（图4h-j）。这些结果为这种基因疗法治疗MPSIVA病的骨病理学提供了强有力的证据。

图4. AAV9介导的Galns表达可防止骨骼病变。 

牙齿异常改变是MPSIVA患者的常见特征。在2个月大的MPSIVA大鼠中，牙齿错牙合、脆性和釉质发育不良已经很明显（图5a）。相反，AAV9-Galns处理的MPSIVA大鼠门牙完整，咬合和釉质正常（图5a）。 

通过下颌骨切片中门牙的LIMP2免疫染色显示，产生釉质的成釉细胞和乳头层细胞中存在明显的溶酶体扩张，导致釉质发育不良（图5a、b）。AAV9-Galns治疗纠正了这些细胞的储存病变（图5b）。MPSIVA大鼠切牙的超微结构分析显示成釉细胞中有大量的储存液泡。在使用AAV9-Galns基因治疗后，病理性溶酶体积聚降低（图5c）。

图5. AAV9-Galns基因治疗可防止牙齿异常改变。 

KS累积改变MPSIVA患者的关节软骨，导致严重的骨关节炎，最终需要骨科手术。在4周龄的MPSIVA大鼠中，与WT大鼠相比，用藏红O染色和LIMP2免疫染色对胫骨软骨切片的分析发现软骨细胞肥大增加（图6a-c）。在8周龄时，在MPSIVA大鼠的关节软骨切片中观察到LIMP2信号加剧，这与进行性KS积聚和溶酶体扩张一致（图6d、e）。对MPSIVA大鼠注射AAV9-Galns，可显著纠正关节软骨中的储存病变（图6d、e）。并且在治疗后，死亡率显著降低（图6f）。 

对6个月大的MPSIVA大鼠肱骨软骨切片进行组织学分析，并用藏红O染色，发现存在骨关节炎，在关节软骨最浅层有大量肥大软骨细胞（图6g）。注射AAV9-Galns能够减少该层中肥大软骨细胞的数量（图6g）。胫骨关节软骨表层软骨细胞的超微结构分析显示，与未经治疗的动物相比，AAV9-Galns基因治疗的MPSIVA大鼠减少了储存囊泡（图6h）。 

对MPSIVA大鼠给药11个月后，发现软骨细胞肥大程度减少，并防止了膝关节软骨丢失（图6j、k）。这与注射AAV9-Galns的大鼠关节软骨中基质金属蛋白酶表达的正常化一致，有助于骨关节炎的预防（图6l）。此外，在滑膜中观察到的溶酶体扩张在AAV9-Galns治疗后正常化（图6m）。与关节改变一致，MPSIVA大鼠在2个月大时已经表现出握力下降（图6i）。AAV9-Galns基因治疗的MPSIVA大鼠表现出与WT大鼠相似的行为（图6i），这表明AAV9-Galns基因治疗可改善MPSIVA的骨关节炎病变。

图6. AAV9-Galns基因治疗关节软骨病变。 

在MPSIVA患者中观察到的最严重的非骨骼表现是呼吸和心血管并发症，这也是致死的主要原因。在MPSIVA大鼠中观察到气管透明软骨、呼吸上皮和固有层的改变。AAV9-Galns基因治疗提高气管和肺中的Galns表达和活性，修正软骨细胞、睫状体细胞和成纤维细胞的储存异常（图7a-f），逆转MPSIVA患者呼吸道的病变。 

同样，在注射AAV9-Galns后，MPSIVA大鼠心脏中观察到高水平的Galns表达和活性（图7g）。然而，Morquio患者的主要心脏异常是瓣膜。TEM分析显示MPSIVA大鼠二尖瓣的储存异常（图7h），而AAV9-Galns可以修正二尖瓣细胞的储存异常（图7h）。 

此外，在MPSIVA大鼠的LIMP2免疫染色，还观察到主动脉壁切片平滑肌纤维的溶酶体扩张，而在AAV9-Galns处理的MPSIVA大鼠中正常化。AAV9-Galns处理的MPSIVA大鼠主动脉纤维的超微结构分析，发现没有液泡，说明储存异常得到修正（图7i）。

MPSIVA大鼠的瓣膜功能障碍和主动脉壁改变可能导致心率增加（图7j），患者的心率也会改变。而用AAV9- Galnsa基因治疗MPSIVA大鼠也能使心率正常化（图7j）。

图7. AAV9-Galns治疗气管和心脏病。 

作者以清晰的研究思路和扎实的实验数据，证明了AAV9-Galns基因治疗在MPSIVA疾病的治疗作用。这个过程包括了动物模型构建、AAV9递送系统效率的验证、疾病表型检测和治疗后有效性评价，这也是基因治疗研究的常规套路。 

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