【操作步骤】SARS冠状病毒的PUMC01株分离自中国SARS病人，在Vero细胞上培养传代，经RT-PCR、全基因测序和电镜形态观察确定为SARS冠状病毒，病毒TCID50为10的6次方/ml。动物用1～3岁恒河猴，由中国医学科学院医学生物学研究所提供。接种前按实验用猴国家标准微生物SPF级进行复检，检查显示 SARS病毒抗体为阴性。恒河猴经鼻腔接种100000 TCID50(1ml体积)病毒；所有动物实验均在SARS专用ABSL-3实验室中进行。所有的实验猴每日检测肛温和进行血液常规检查，观察白细胞计数的动态变化。观察有无咳嗽、流涕、呕吐、皮疹、腹泻、气促、呼吸困难、明显食欲不振等临床表现。在SARS冠状病毒接种恒河猴1d后，每天收集咽拭子标本，充分浸泡在1ml DMEM培养液中，经0.22μm滤膜过滤后，接种Vero细胞进行病毒分离。尸检时取血浆、肺、肝、脾和肾组织，研磨处理后，如上方法接种 Vero细胞。在ABSL-3实验室内提取病毒RNA，用对应于SARS冠状病毒1b区的引物进行巢式RT-PCR检测。恒河猴在SARS冠状病毒接种后第5d始至安乐死时，每隔124h经静脉采血1ml分离血清，-80℃下保存备用。血清SARS冠状病毒特异性抗体(IgG)检测采用“SARS冠状病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫法) IgG”(北京华大吉比爱生物技术有限公司)。中和抗体测试用尸检时的血清以1:2至1:512进行2倍系列稀释，加入100 TCID50量的病毒，在37℃培养箱中，中和1h后，接种96孔细胞培养板中，每个血清浓度接种4排孔，培养1周，观察细胞病变，计算保护50％细胞不被感染的血清稀释度。病理学研究包括大体观察：动物在感染的第5、7、10、15、20、30和60d，分别安乐死动物，组织病理取材，详细观察肺、心、脾、肾、肝、脑、肠、胃以及淋巴结等组织的形态变化；病理切片制备：病毒接种的第5d开始安乐处死动物，取肺等组织，10％甲醛固定，石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，HE染色、Gomori's银染和ABC免疫组化方法染色，镜检。

【结果分析】

(1)所有的实验猴在实验前1周测正常体温和外周血常规，感染后每日检测肛温和进行血液常规检查，观察白细胞计数的动态变化。恒河猴在病毒接种的第2～5d时有一过性的体温升高，为39～40℃，随后恢复到正常38.5℃左右。白细胞在感染1周时处于正常范围E(4～10)×10的9次方个/升]的偏低值[(4～8)×10的9次方个/升]。部分动物有呼吸困难，摄食减少，胸腹部皮肤出现皮疹。未见咳嗽、流涕、呕吐、腹泻等临床表现。X光检查肺未见明显改变。

(2)病毒分离培养、病毒RNA检测：从恒河猴接种5d的咽拭子标本中，经Vero细胞培养，产生了典型细胞病变(CPE)。病毒接种第5d全部可从咽拭子中检测到大小为797bp的目的条带，阳性检出最长可持续到第15d。

(3)恒河猴接种病毒前SARS冠状病毒特异性抗体IgG及中和抗体均为阴性。猴在10d内为阴性。感染猴在11～15d开始，至安乐死时，SARS冠状病毒特异性抗体IgG均为阳性，并有一定的中和抗体产生。

(4)大体肺组织表面局部有轻度实变现象，未见明显其他改变。肝、肾、脾及淋巴结等组织未见病变。

(5)在感染5、10、15、20、30、60d，对恒河猴进行病理检查，见彩图13.1～13.7。                                   

根据Koch理论要求，确定一种病毒性疾病须满足以下6个指标，即：从患者体内分离到病毒、能经宿主细胞培养、可滤过性的证明、在原宿主或相关宿主体内可复制相似疾病、重复分离病毒以及检测到体内为此产生的特异性免疫反应。大量的临床和实验室研究证实了SARS的前3项指标，荷兰Osterhaus实验室初步证实 SARS病毒经气管可以感染食蟹猴，分离并鉴定到了相关病毒，也检测到了SARS冠状病毒特异性抗体(仅2只在16d时)，初步证实了后3项指标。鉴于荷兰小组所用的猴子数量很少(4只)，有关指标也不尽完善，如详尽的病理学改变，包括免疫组织学染色等，我们认为，有必要进一步对SARS病毒易感的动物进行系统的研究。与临床病理学观察相比，动物模型在阐明病毒致病性方面具有很多优势：(1)临床病理学研究观察到的都是死亡病人晚期的结果，对于早期病理改变是看不到的，因此使用动物模型对SARS的动态病理学变化有了初步了解。(2)临床病例往往发生继发感染，我们所见到的是混合感染的结果，而在动物模型上看到的是单纯病毒感染造成的病理损伤，能更真实地反映病毒的致病性。(3)临床上看到的病理改变是经过药物治疗后的，也不能代表实际的病理变化。因此，利用模型动物将在SARS致病性研究中发挥重要作用，病理学改变为药物筛选、疫苗评价等方面的研究奠定了重要基础。

【注意事项】试验在ABSL-3实验室进行，试验人员经过生物安全培训。