摘要：纤维发育不良（FD）是一种罕见的遗传性骨疾病，由鸟嘌呤核苷酸结合蛋白基因（GNAS）突变引起，导致cAMP过度产生，导致组织结构不健全。为了更好地了解这种疾病，已经开发了几种具有不同方法和特征的动物模型。进行系统评价，分析和比较动物模型与 FD 的致病突变和特征。

关键词：纤维发育不良  体内  动物

简介：纤维发育不良（FD）是一种罕见的骨疾病，导致纤维骨组织替代正常骨。结构不健全的组织会导致畸形、骨折和疼痛，从而降低患者的生活质量，并可能导致严重残疾。FD 病因是由于 GNAS 基因的合子后置换突变，，特别是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 (Gαs) 的刺激性 α 亚基； 外显子 8 中 201 密码子的精氨酸残基通常被半胱氨酸或组氨酸 (R201C/H) 取代。极少数情况下，密码子 227 的突变也会导致 FD。 这些镶嵌突变导致环磷酸腺苷 (cAMP) 的过度产生失调。导致 FD 的突变也可导致骨骼外疾病，并且 FD 与一种或多种骨骼外特征的组合称为 McCune-Albright 综合征 (FD/MAS)。最常见的受累骨骼外部位是皮肤（色素沉着斑）、多个内分泌组织（包括性早熟、甲状腺机能亢进或生长激素过量），偶尔还有骨骼肌（肌内粘液瘤）。由于疾病的嵌合性和 Gαs 的广泛表达，表型可能性的范围很广，因此 FD/MAS 的表现在每个患者中都是独一无二的。FD 的主要临床特征包括骨骼畸形和骨折，在严重的情况下可能导致功能障碍，例如丧失视力、听力和行走能力。患者也可能会经历疼痛，成年人的患病率和疼痛强度更高。FD表现出与年龄相关的表型：在临床上早期病变明显，成年后，病变的代谢活性降低，骨折率下降。由于骨和骨髓被纤维骨组织替代，病变的 X 射线呈“毛玻璃状”外观。然而，成像技术（包括计算机断层扫描和磁共振成像）、畸形和骨折本身并不适合诊断FD。需要对FD/MAS的骨骼和骨骼外特征进行完整的临床评估以确认诊断，在不确定的情况下，可能需要对受影响组织进行分子诊断。苏木精和伊红染色显示编织骨中存在Sharpey纤维，Von Kossa染色显示骨的去骨化和骨髓缺失。骨转换标志物水平升高支持 FD 的诊断，碱性磷酸酶 (ALP) 是 FD 中推荐的最低生物标志物； 疾病负担越大，骨转换标志物的升高就越大。FD 还影响磷酸盐和维生素 D 调节激素、成纤维细胞生长因子 23 (FGF23) 的生成，在大部分 FD 患者中，FGF23 升高且患者出现低磷血症。FD/MAS目前无法治愈，降低了患者的生活质量。对这些患者的护理有时是无效的，比如疼痛。一些病例研究表明，denosumab可能是FD患者疼痛的一种有希望的治疗方法。这种疾病的罕见性使得研究其病理学和进展以及为临床研究建立适量的样本量具有挑战性。尽管如此，一个由专门的临床医生、研究人员和患者拥护者组成的国际联盟已经为FD/MAS的定义、诊断、分期、治疗和监测制定了临床指南。然而，建立合适的FD动物模型势在必行。动物模型是研究疾病发病机制和进展的宝贵工具，并提供了测试可能帮助患者的新治疗方案的手段。迄今为止，有几个研究小组提出了使用主要致病GNAS R201突变的FD模型，并报告了与人类FD相似的特征，证明了模型的结构和面部有效性。然而，这些模型是使用不同的方法创建的，并表现出独特的特征，每种都有其优点和缺点，这使得研究人员很难确定哪种模型最适合模拟这种复杂疾病的特定方面。此外，已经开发出一些转基因小鼠模型，这些模型不表达FD相关GNAS突变，而是引起G蛋白偶联受体（GPCR）/Gαs/cAMP通路激活，以模拟FD表型的某些方面。 Lung等人 回顾了 FD/MAS 的关键临床表现、靶向 Gs GPCR 信号通路的小鼠模型的现状以及人类细胞模型。然而，没有对可用动物模型或信息进行比较来确定当前研究中的差距以及可能需要进一步研究的内容。本系统评价的目的是分析和比较当前表现出致病 GNAS R201 替代突变的 FD 动物模型，并将患者的 FD 病理学与动物模型中实验评估的病理学进行比较。包括任何具有FD相关GNAS R201替代突变的实验动物物种的研究都被考虑在内，但前提是该模型包括不表达FD相关GNAS突变的适当对照。

搜索产生了 696 篇文章，其中 667 篇根据排除标准被排除，其余 29 篇被评估为可能纳入定性评估。 根据纳入和排除标准，纳入八项研究进行定性评估。在搜索过程中，15 项研究被确定为不符合 GNAS 突变纳入标准的机制研究； 然而，他们报告了 FD 样病变，并被纳入子分析，因为他们可以提供有关可能导致 FD 表型的机制的信息。六项研究被排除在外，因为他们建立了一个模型，在该模型中，来自人类FD病变的细胞被移植到小鼠体内，因此动物本身没有携带致病性或机制性突变。这些模型的分类如图 2 所示，以建立本次审查中评估的模型的标准化命名法。确定了七种独特的致病小鼠模型。 这七个模型的研究均未评估或报告与 MAS 相关的骨骼外发现的发展。 另外两个模型（Col1a1-Bianco 和 Sox2-Yang 模型）没有发展出 FD 表型，但对它们可能产生的有关 FD 的信息进行了分析。

图 1. PRISMA 流程图展示了定性综合的搜索结果和文章。

图2. 系统搜索产生的FD不同动物模型分类流程图

致病模型是使用多种遗传策略开发的，以驱动突变 GαS 的表达。使用的启动子允许通过细胞类型或发育阶段进行普遍或组织特异性表达。在大多数模型中，基因突变是随机插入的，或者在其他模型中使用同源GNA替换。开发了一些模型以允许突变基因的诱导表达。最后，不同的模型使用来自不同物种的带有R201C或R201H突变的GNA。EF1α-Riminucci和PGK-Riminucci模型是通过分别在受精胚胎基因组中EF1α和PGK启动子下随机插入大鼠GαSR201C cDNA而建立的。这导致基因的普遍存在和组成性表达以及随后的FD发展。Prrx1-Gutkind 模型涉及三个转基因构建体。 第一个转基因由受 Prrx1 启动子控制的 Cre 重组酶 (Cre) 组成，在间充质的胚胎发生中瞬时表达，从而产生附肢骨骼和顶骨的某些区域。第二个转基因编码了一个四环素诱导转录因子（逆转录四环素反式激活子，rtTA），由一个组成型 ROSA26 启动子驱动，但被一个 floxed STOP 密码子抑制。在胚胎发生过程中，该密码子将在表达 Prrx1 的细胞中被去除，从而允许 rtTA 在这些细胞及其后代中组成型表达。第三个转基因是人 GαSR201C cDNA，由四环素诱导元件控制。 在这些小鼠出生后给予强力霉素后，诱导GαSR201C 表达并在附肢骨骼和顶骨的某些区域形成损伤。Yang组的所有模型均使用一种小鼠品系开发，其中一种内源性Gnas等位基因包含R201H突变，野生型外显子 7-12 位于突变内源基因的外显子 8 上游。在缺乏Cre的情况下，该Gnas等位基因表达WT基因，当存在Cre时，突变基因被表达。该品系与不同的 Cre 品系杂交以获得不同的 GnasR201H 表达模式，尽管仍受内源启动子的调节。他们使用了一种小鼠，其中 Cre 在四环素调节的 Osx 启动子（Osx-Yang 模型）、Prrx1 启动子（Prrx1-Yang 模型）和在 Sox9 控制下表达的他莫昔芬诱导型 Cre （Sox9-Yang）下表达。最后，通过在组成型启动子下将 floxed 大鼠 GαSR201H cDNA 构建体随机插入小鼠基因组中来生成 Prrx1-Bastepe 模型。然后将这些小鼠与 Prrx1-Cre 小鼠一起饲养，以确保该基因仅在骨骼干细胞中表达。发病时间——定义为 FD 表型的初始表现，无论是从诱导（即四环素诱导）还是从受精/出生（即组成型表达）——在模型之间差异很大。一些模型在诱导后两周内表现出 FD 表型（Prrx1-Gutkind 和 Prrx1-Yang），而另一些模型在产后 2-3 个月（EF1α-PGK-Riminucci 模型）出现。在不同的小鼠模型中，GαsR201H的表达表现也不同。尽管两种 Riminucci 模型都允许 GαsR201H 普遍表达，但据报道它们首先出现在远端尾部（2-3 个月），然后进展到后来包括长骨、脊柱、短骨、颅骨、肋骨和骨盆。Prrx1 在骨骼干细胞中表达。因此，Prrx1 对照模型报告了四肢骨骼中的 FD 样病变。Prrx1-Bastepe 和 Prrx1-Gutkind 在颅盖区域也出现病变，并且 Prrx1Yang 模型显示受累的顶叶和顶叶间区域。 Osx 启动子允许在整个骨骼的成骨祖细胞中表达； 然而，目前尚不清楚病变出现的确切位置，因为肱骨和颅骨是文章中检查的唯一区域。Sox9 启动子确保在骨髓区域的间充质前体细胞中表达； 然而，在文章中，我们只知道它是在肱骨上进行评估的。研究报告的小鼠性别不一致。使用 PGK-Riminucci 模型的研究和关于 EF1α-Riminucci 模型发展的研究没有报告小鼠的性别。然而，以下使用 EF1α-Riminucci 模型、 Prrx-Gutkind 和 Prrx1-Bastepe 模型的研究报告了小鼠的性别。

图 3. (A) EF1α-和 PGK-Riminucci 模型，(B) Prrx1-Gutkind 和 Prrx1-Yang 模型中报告的 FD 样病变部位的示意图。

临床特征：所有模型均因骨生长异常和“FD 样病变”而导致畸形。 没有一个模型评估 FD 的诱导是否会导致动物疼痛，无论是由于疾病发展还是由此导致的骨折。在EF1α-Riminucci模型和Prrx1-Gutkind模型中，通过x射线和μCT观察到微裂缝。

骨成像 - 外观、密度和微结构：所有模型都出现了 FD 的多骨表型。 在 EF1α-和 PGK-Riminucci 模型以及 Prrx1-Gutkind 模型中观察到 X 射线中 FD 的“毛玻璃”外观。其他研究没有提到这一点； 然而，Prrx1-Yang 模型的 X 射线图像显示毛玻璃不透明。 在 EF1α- 和 PGK-Riminucci 模型、Prrx1-Gutkind 模型 (μCT) 和 Prrx1-Yang 模型 (μCT) 中呈现出一种被破坏的骨表型。在EF1α-Riminucci模型、Prrx1-Gutkind模型和Prrx1-Yang模型中报告了皮质骨丢失。Prrx1-Gutkind 和 Prrx1-Yang 模型还报告了 FD 病变的膨胀性畸形。Prrx1-Gutkind、Prrx1-Yang 和 Osx-Yang 模型都使用 μCT 扫描对骨骼病变进行成像，尽管 μCT 在 Osx-Yang 模型中的病变外观与 FD 临床所见并不典型，但它显示增加的骨量类似于下面描述的 Col1a1-Rs1 模型。

组织学/组织形态计量学：除Prrx1-Bastepe模型外，所有模型均出现编织骨和密度可变的纤维组织损伤，这是人类FD的特征，没有清晰的骨髓和小梁区域。这些模型还显示出异常的小梁。 只有 Prrx1-Gutkind 模型报告了造血功能的丧失。Prrx1-Gutkind 模型和 EF1α- 和 PGK-Riminucci 模型均显示 FD 病变中存在纤维骨组织。Sharpey 纤维（垂直于骨表面的胶原束，FD 组织学特征）存在于 EF1α-Riminucci 模型、Prrx1-Gutkind 模型和 Prrx1-Yang 模型中。Prrx1-Gutkind 模型还显示出异常形状（星状、缩回）的成骨细胞。TRAP 染色和组织形态学分析证实 EF1α- 和 PGK-Riminucci ， Prrx1-Gutkind 和 Prrx1-Yang 模型破骨细胞数量增加。Osx-Yang模型在组织学图像中显示骨质增生，这不是FD组织的典型发现。

组织化学和细胞标记物：在EF1α-Riminucci和Prrx1-Gutkind模型中，成纤维细胞样FD细胞显示出ALP蛋白的局部表达增加。在Osx-Yang和Prrx1-Yang模型中，ALP mRNA表达增加。EF1α-和 PGK-Riminucci 模型和 Prrx1-Gutkind 模型显示其模型中培养的骨髓基质细胞 (BMSCs) 中 cAMP 增加，而 Prrx1-Gutkind 模型也显示磷酸化 CREB 蛋白与 cAMP 信号增加一致。 在 Prrx1-Gutkind 模型中 Runx2 蛋白表达增加，在 Osx-Yang 模型中 Runx2 mRNA 表达增加。Prrx1-Bastepe模型显示培养的BMSCs中c-fos基因表达增加。然而，没有其他研究对模型中的c-fos表达进行评估。尽管FD患者血清骨钙素水平持续且经常显著升高，但在Prrx1-Gutkind模型BMSCs中，骨钙素蛋白表达降低，在Osx-Yang模型中，肱骨组织中骨钙素mRNA表达降低。EF1α-Riminucci和Prrx1-Gutkind模型显示成纤维细胞样FD细胞中RANKL的局部蛋白表达增加。从Prrx1-Gutkind和Prrx1-Yang模型获得的组织中RANKL和RANKL/OPG mRNA表达增加。Prrx1-Yang和Sox9-Yang模型显示β-连环蛋白的局部蛋白表达增加，这表明Wnt/β-连环蛋白途径被激活。最后，通过TRAP染色，EF1α和PGK-Riminucci、Prrx1-Gutkind和Prrx1-Yang模型也显示破骨细胞数量增加。

血液和/或尿液标记物：Prrx1-Gutkind 的循环 RANKL 增加。 EF1α-Riminucci 模型报告 P1NP 或 C 端肽的血清蛋白没有变化。 没有一项研究使用尿液来检测生物标志物。

具有致病性GNAS突变但不具有FD的模型：Col1a1-Bianco 模型：Remoli等人开发了一个模型，其中GαSR201C在Col1a1启动子的控制下表达（在分化和成熟的成骨细胞中表达）。该模型出现了高骨量表型，但没有出现 FD。 这个 Col1a1-Bianco 模型没有证明矿化减少； 相反，观察到整个骨骼的骨质增生。使用 μCT 观察到的骨骼结构与在 FD 中观察到的不相似，并且保留了造血功能。 与在 FD 患者中观察到的相反，模型中也明显没有骨折和 Sharpey 纤维。然而，在该模型中观察到了一些在FD中也可见但并非特定于FD的特征。受影响动物的局部ALP蛋白表达增加，培养的成熟成骨细胞显示cAMP增加。此外，从受影响动物分离的BMSCs显示骨钙素mRNA的表达降低。最后，该模型显示循环FGF23增加；然而，导致FGF23增加的机制似乎与FD不同。

Sox2-Yang模型：Khan 等人开发的 Sox2-Yang 模型。 是胚胎致死的，因此不会产生 FD 表型。 开发此模型是为了在 Sox2 启动子下表达胚胎干细胞中的 R201H 突变，以证明该突变导致胚胎致死率。GNASR201H的表达发生在受精后5-10天，胚胎在12.5-15.5天死亡。进一步研究表明，胚胎中Wnt/β-连环蛋白信号转导增加。

局限和结论：纳入或排除文章的依据是研究是否声称已发展出FD样表型，而不是对FD样表型的产生进行独立的基于事实的评估。这证明了疾病分类的复杂性：特征本身不足以识别疾病，而是需要结合 FD 的许多关键特征才能将其分类。因此，除了使用适当的致病或机制遗传策略外，还必须进行各种水平的测试，包括临床观察、影像学、组织学和血清学，以评估可能的 FD 样表型。此外，大多数研究中提供的选定图像和数据通常不足以对疾病进行分类，仅依赖作者的报告。本文排除了离体和体外研究，这将有助于突出当前可用模型的广谱性和它们产生的信息。总之，有许多体内致病模型产生FD表型。根据调查对象的不同，这些模型具有不同的功能，可用于不同的需求。这些模型可用于各种各样的应用，包括但不限于研究有助于FD表型的机制，确定治疗靶点，了解当前治疗药物的作用机制，以及测试FD的新治疗药物。还创建了其他模型，这些模型不代表 FD 表型，但仍阐述 FD 中涉及的机制。 FD/MAS 是一种罕见的遗传性疾病，与显著的发病率相关。开发FD/MAS体内模型不仅促进我们对骨生物学的总体理解，而且也促进我们对FD病理机制的理解，并肯定有助于FD患者治疗的进展，以减轻他们的痛苦。

原文出自：Fibrous dysplasia animal models: A systematic review - ScienceDirect