原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我国癌症死亡的主要原因之一，包括肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和混合型（combined HCC-ICC，cHCC-ICC），因其发病隐匿，进展快，导致80%的患者就诊时已是晚期，五年生存率仅为19%。早筛早诊对于预防肝癌和提高肝癌患者的生存率至关重要，在过去几十年中，虽已引入了新的成像技术和血清学标志物检查来提高诊断能力，然而，许多技术对于PLC筛查并不是最佳的，并且它们的应用受到不同因素的限制，因此目前的研究聚焦于开发出简便快捷的早期筛查方法。

细胞外游离DNA（cell-free DNA，cfDNA），是指细胞凋亡和坏死后，释放入血的DNA片段，因而cfDNA携带原始组织细胞的遗传表观信息，为液体活检中的实体肿瘤诊断提供了安全、简捷、微创等优势。

近日，复旦大学附属中山医院樊嘉院士、周俭教授和王征教授团队，使用肝癌患者的血浆cfDNA样本进行了低深度的全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS），基于片段组学的机器学习，建立了肝癌早筛模型，该模型区分肝癌和非肝癌的曲线下面积（area under the curve，AUC）高达0.995，在98.8%特异性下灵敏度高达96.8%，显示出优异的预测性能。该研究成果目前已发表于肝脏病学顶刊Hepatology（图1）。

图1. 研究成果（图源：Hepatology）

本研究在2019.06-2020.12期间，共招募716名受试者，包括原发性肝癌（PLC）患者381例和非肝癌对照335例（乙肝和/或肝硬化高风险人群104例，健康人群231例）。根据受试者临床病理特征，按照1：1分为训练队列（N=362例）和验证队列（N=354例），两个队列中肝癌亚型 （HCC、ICC和cHCC-ICC）的分布和真实世界中的比例一致。分别收集受试者的血浆cfDNA样本进行低深度的WGS，获得了cfDNA片段组学特征。然后，对cfDNA片段的两个相关特征，即：片段大小分布（Fragment Size Distribution，FSD）和片段大小比值（Fragment Size Ratio，FSR），在训练队列中进行机器学习，并构建了三种基本的子模型，经检验有效后整合出肝癌早筛模型，进而在验证队列中对其进行系统验证（图2）。

图2. 研究和队列设计示意图（图源：Hepatology）

研究结果显示，肝癌早筛模型的预测性能优越。在区分肝癌和非癌方面，AUC高达0.995，在98.8%特异性下灵敏度高达96.8%；对于肝癌和肝硬化/乙肝高风险人群，显示性能仍优越，特异性达96.1%；对于肝癌和健康人群，体现出更佳的预测性能，特异性可达100%（图3）。

图3. 使用验证队列来评估模型的性能（图源：Hepatology）

研究人员将模型在临床亚组中进行了验证，结果发现，对于不同的病理类型，肝癌早筛模型的预测性能仍优异：检测HCC的敏感性达96.2%，而检测ICC和cHCC-ICC的敏感性均高达100%。同时，该模型在极早期肝癌（TNM IA期/BCLC 0期/CNLC Ia期）、甲胎蛋白阴性（AFP＜20ug/L）、低总胆红素（TBIL）、低白蛋白以及小肝癌（＜3cm）中均有优异的预测性能（图4）。与传统的肝癌生物标志物AFP（AUC 0.781）相比，此模型（AUC 0.985）显示出更好的预测性能，能有效提升筛查效果。

图4. 肝癌早筛模型在肝癌不同临床亚组中的预测性能（图源：Hepatology）

虽然该模型使用的测序深度已低至4X，为了能继续降低筛查成本，研究人员将样本测序深度依次减至3X、2X、1X和0.5X，结果显示，早筛模型在超低测序深度测序下保持了一致的优异性能。即使测序深度降至1X时，肝癌筛查模型在区分肝癌和非癌的AUC也可达0.994，在98.8%特异性下灵敏度高达93.7%（图5）。

图5. 肝癌早筛模型在降低测序深度时的预测性能（图源：Hepatology）

PLC的两种主要组织学类型，HCC和ICC分别约占所有肝癌的75%和12-15%，因为这两种疾病在治疗上有着显著差异，所以区分HCC和ICC在临床上也很重要。最后，研究人员使用验证队列中的HCC（N=159例）和ICC（N=26例）样本进行验证，区分HCC和ICC的AUC达0.776，显示出该肝癌早筛模型在区分HCC和ICC上有潜在的临床应用价值（图6）。

图6. 肝癌早筛模型区分HCC和ICC的性能（图源：Hepatology）

本次中山医院团队构建的肝癌早筛模型荣登肝脏病学顶刊Hepatology（影响因子17.4），在短时间低成本的条件下即可实现高特异性和敏感性，为液体活检尽早推广应用于临床肝癌早筛提供了有力证据，更为其他癌症的早筛早诊奠定了坚实的基础。

参考资料：

[1]Zhang X, Wang Z, Tang W, et al. Ultra-Sensitive and Affordable Assay for Early Detection of Primary Liver Cancer Using Plasma cfDNA Fragmentomics. Hepatology. 2021 Dec 25. doi:10.1002/hep.32308.