分子诊断主要检测基因的序列结构和表达水平，主要的检测技术包括PCR、高通量测序、荧光原位杂交（FISH）、基因芯片等。其中，PCR与高通量测序等应用最为广泛。 

PCR技术的原理是以样品DNA为模板，在聚合酶、引物和dNTP等扩增体系下复制出大量的子代DNA。第一代PCR通常在扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，一般需要结合一代测序才能对基因型做定性分析。第二代荧光定量PCR（Real-Time PCR），也叫做qPCR，在反应体系中加入荧光物用于指示反应进程，利用荧光信号的变化来监测扩增产物的变化，通过荧光曲线来判断结果，并可以借助Cq值和标准曲线来定量。第三代PCR 微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）也用于定量分析，相比于二代PCR灵敏度更高，能测定基因拷贝数。其原理是将反应体系分为成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经过扩增后，再通过检测荧光信号，并根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例计算出模板数量。 

二代测序由于通量高，在检测多个样品和多个位点时，能节省时间、降低成本，所以在分子诊断中有巨大的应用潜力。其原理是通过模板DNA 分子的化学修饰，将其锚定在纳米孔或微载体芯片上，利用碱基互补配对原理，在 DNA 聚合酶链反应或 DNA 连接酶反应过程中，通过采集荧光标记信号或化学反应信号，实现碱基序列的解读，一次性可完成几十万至上百万条序列的测定。 

分子诊断的应用场景很多，如今主要应用的领域有无创产前检测（NIPT）、伴随诊断、肿瘤早筛和传染病检测等。 

NIPT是通过高通量测序等手段，检测母体内的胎儿遗传信息，判别胎儿是否患染色体异常疾病，包括21 三体综合征（唐氏综合征）、18 三体综合征（爱德华氏综合征）、13 三体综合征 （帕陶综合征）。NIPT具有检测准确率高、周期短、漏诊率低和对母体损害低等优点。 

伴随诊断是分子诊断的另一个应用领域。在使用分子靶向药前，需要先检测患者是否存在药物靶点，提高用药的准确性。常用的检测方法有PCR、NGS、FISH和免疫组化（IHC）等，其中PCR测序是常用的检测手段，具有快捷准确等特点。

表1. 分子诊断各技术在伴随诊断中的应用特点。 

在肿瘤早筛中也会应用到分子诊断技术。肿瘤形成的其中一个重要原因是基因突变。因此尽早筛查出这类人群，开展预防和治疗是很重要的。现阶段多通过内镜、组织活检等手段检测，但操作麻烦、准确性不高且存在漏筛。而基于 PCR、NGS 等分子诊断技术的液体活检则具有很大的应用潜力，其原理是通过检测从转移灶释放到血液中的肿瘤细胞或者DNA。具有取样方便、灵敏度高、非侵入性、有效应对肿瘤异质性、在疾病发展的不同阶段可重复取样等优势。 

分子诊断在传染病筛查的应用主要体现在新冠检测和血液筛查。在新冠筛查中，主要应用qPCR检测，能快速准确地筛查出感染者，是减少新冠传播的有力手段，具有精准度高和辨识度强等特点。血液筛查是为了确保血液制品的质量、避免交叉污染和保护工作人员的安全，防止相关疾病的感染者进入供血队伍。这些疾病包括：人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒 （HCV）、梅毒螺旋体、丙氨酸氨基转移酶（ALT）等。早期以酶免检测（ELISA 技术）为主，但是灵敏度低。而以 PCR 技术为主的核酸检测（NAT）具有更高的灵敏性和特异性，能显著降低输血感染病毒带来的风险。 

分子诊断的流程具有多个环节，从样品样本提取到变异检测，每个环节都存在不确定因素和不可规避的系统误差，这使得分析结果存在假阳性或假阴性的可能。因此需要标准品，来检测与校对分析体系的准确性。 

分子诊断标准品应该具备以下3个特征:

1.  代表性。标准品需要与待测样品在基因遗传背景、细胞类型、组织类型和处理方式等方面高度相似，才能模拟待测样品的检测过程，以分析实验体系的精准度和判别待测样品结果。 

2. 可量化。标准品需要具备突变频率阶梯性，将编辑细胞与野生型细胞以不同比例混合，用于模拟不同疾病或检测系统的检测上下限。 

3. 持续稳定。标准品需要能持续且稳定生产。 

在PCR检测变异的流程中，可以用标准品来验证试剂盒的提取效率、变异检测的准确度、试剂盒的灵敏度等。在核酸提取步骤中，样本经过不同的处理往往对核酸提取率有影响，比如经过福尔马林、石蜡包埋等处理等。如果存在与患者样本处理方式、材质、细胞复杂性和结构特性相似的标准品，例如FFPE标准品，则可以在提取环节中得知提取效率。如果更换提取体系时，只要使用相同的标准品，还可以比较不同提取体系的提取效率。同理，标准品在文库构建阶段和测序阶段也发挥着相同的作用，用于确定建库效率和测序质量。 

生信分析位点变异情况时，由于标准品的突变位点、突变基因型和突变频率等信息都是通过人为修饰且已知，所以如果信息分析流程得出的变异检测结果与此不符，就需要调整参数，以得到准确的分析体系，同时还能准确判断患者样品的实际变异情况。 

基因点突变通常指单个碱基的替换或插入缺失。随着CRISPR-Cas9技术的发展与应用，不管是基于同源重组（HDR）或单碱基编辑系统的基因点突变修饰变得更加容易实现。全球有超过50000种人遗传疾病，其中大部分是由基因组的点突变引起的。例如罕见病，点突变引起的占了50%。对于这些疾病的分子诊断就显得更为重要。同样的，这些基因点突变疾病的分子诊断也会面临上述的问题：需确保分析体系的准确性。此时以点突变细胞作为分子检测的标准品，便可以解决。 

随着精准医疗的概念不断深入人心，分子诊断越来越贴切我们的生活，同时由于技术的不断发展，PCR、高通量测序等技术的灵敏度、精确性和成本都不断再改善，促使分子诊断行业快速发展。但由于检测系统存在不可消除的系统误差或不确定因素，检测结果可能出现假阳性或假阴性。那么设置分子诊断标准品，消除系统误差则显得十分重要。 

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