在NIH指南中，二氧化碳安乐死方法是安乐死小型动物（包括小鼠、大鼠、豚鼠及仓鼠）的主要方法。虽然使用二氧化碳安乐死通常是可接受的，但前提是必须符合美国兽医协会（AVMA）《动物安乐死指南》（以下简称指南）中的要求。动物安乐死方法必须符合实验研究的目的，且动物的种属、日龄及相关福利要求必须符合最新的指南要求，除非其科学合理性已通过IACUC的批准。

二氧化碳安乐死应尽可能保证动物迅速并无痛苦的死亡，以下方面需要考虑：

1.啮齿类动物安乐死操作须由专业人员经过培训后进行，且使用专业设备和药剂。

2.不同种属的动物禁止同时实施安乐死。

3.应尽可能在原笼实施安乐死。另一种可接受的通常做法是将动物放入同一笼盒后进行安乐死。此时，须避免动物过度的拥挤。放入同一笼盒的动物在立即实施安乐死之前，应保证每只动物在笼中都有空间完成正常姿势调整。

4.实施安乐死不应在动物原饲养间进行。

5.安乐死时所使用的笼盒应能易于操作者观察动物。

6.瓶装压缩二氧化碳气体为唯一推荐使用的气体来源，并且其气体流量必须可以控制。禁止使用干冰作为CO2来源或预填充CO2安乐死容器。USP A级（医用）或B级（工业）的钢瓶都是可接受的，其二氧化碳纯度可达到99 %以上。

7.动物放置于安乐死笼盒前，笼盒不允许预先填充气体。而应按照30﹪~70﹪容器体积/分钟的CO2置换率，以均衡的速度充入CO2，从而使动物快速的失去意识，将其痛苦程度尽可能降至最低。

a.如：对于10升体积的安乐死笼盒来说，流速应控制在3~7升/分钟。

b.本文附件1所附公式可用于计算基于笼盒尺寸的适合的流速。

8.安乐死进行期间，动物应在2~3分钟之内失去意识。应持续观察每只动物的呼吸状况及眼睛的颜色。所有动物停止呼吸后需至少再通入1分钟CO2。同时观察到动物呼吸停止、眼睛失去颜色，才可取出动物；否则应将动物继续暴露在CO2环境中。如安乐死实施时，开始充CO2气体2~3分钟后动物还未失去意识，则应检查流速，并对安乐死笼盒及整个管路进行检查，查看CO2气体是否正常供给或是否有泄露。适当的CO2浓度及暴露时间可以防止动物恢复意识。

9.安乐死操作完成后，必须通过另一种适当的方法确认动物死亡，如心跳停止、呼吸停止、动物僵硬以及瞳孔散大等，该步骤在二氧化碳安乐死操作中非常重要。如动物没有死亡，必须使用另一种方法对其进行安乐死，如断头、打开胸腔造成两侧气胸或脱颈。

10.如不能在原笼中安乐死，应保证二氧化碳安乐死笼盒是洁净的，即再次使用之前应彻底转移已死亡动物，并清除杂物及安乐死过程中动物释放的信息素。针对每批安乐死的动物，更换新笼盒也是可行的方法。

11.新生动物（10日龄以内）对CO2形成的缺氧环境具有一定程度的抵抗力，其安乐死参考《美国兽医协会（AVMA）实验动物安乐死指南》（2020版）。

12．早熟性动物中的年轻动物，如豚鼠，应按照成年动物执行。

附件1  啮齿类动物二氧化碳安乐死：气体流速计算

NIH ARAC啮齿类动物二氧化碳安乐死指南规定，啮齿动物实施安乐死时要将CO2流速控制在保障笼盒CO2置换率为30﹪~70﹪容器体积/分钟。下面举例说明如何计算笼盒体积、最大和最小置换率下的气体流速。

原文链接：https://oacu.oir.nih.gov/system/files/media/file/2021-06/b5_euthanasia_of_rodents_using_carbon_dioxide.pdf