摘要：在从猪到非人灵长类动物的肾脏异种移植中，仅使用临床批准的免疫抑制剂来控制免疫反应是很困难的。此外，据我们所知，还没有关于使用胎猪作为肾脏供体的报道。本研究以未经基因改造的猪为供体，食蟹猴为受体旨在比较新生儿和胎儿肾脏移植排斥反应的程度。切除受体猴子的左肾，然后将新生儿和胎儿猪肾移植到腹膜后，在同一部位进行了血管吻合。仅使用美国食品和药物管理局批准的药物进行免疫抑制。.将胎儿肾脏移植到食蟹猴的大网膜和主动脉旁区域。因此，通过一段时间的取样（每次实验两次），对移植组织的植入和发育进行病理检查。几周后，在血管吻合的新生儿肾移植物中观察到急性排斥反应。然而，尽管对猴子和流入胎儿肾脏的受体血管进行了相同的免疫抑制方案，但胎儿猪的肾脏却免于排斥。猪-猴肾异种移植中胎儿肾脏的免疫原性低于新生儿肾脏。

关键词：食蟹猴  猪  肾  胎儿肾  免疫抑制

简介：自从进行第一次器官移植以来，异种移植作为避免器官供体短缺问题的一种手段引起了人们的关注。因此，猪基因工程的先进方法取得了进展。用于异种移植的转基因猪已经生产出来，并且正在以非人灵长类动物为受体的临床前模型中进行验证。近年来，已经有一些报道称，通过使用极强的免疫抑制剂药物进行控制，可以进行长期植入。然而，在猪和非人灵长类动物的临床前模型中，仅使用临床批准用于人类的免疫抑制剂药物进行免疫抑制的效果存在局限性。因此，我们旨在开发一种新的供肾制造治疗方法，该方法将利用组织工程通过体外将人源性肾祖细胞注射到猪胎肾中产生的嵌合胎肾作为异种再生药物。作为实现这一目标的一个初步步骤，本研究在非人灵长类动物模型中检验了猪胎肾作为移植物优于血管化新生儿肾的优越性。从理论上讲，移植胎儿肾脏的流入血管是宿主的，这种方法可以避免血管内皮功能障碍，这是异种排斥反应的第一个靶点。尽管有一些涉及小动物的报告，但据我们所知，目前还没有关于猪-猴临床前模型的明确实验历史的报告。因此，我们认为，本研究是第一次比较和检查模型的植入程度，在使用临床批准的免疫抑制药物的免疫抑制方案下，将未经基因修饰的正常猪和食蟹猴分别作为供体和受体。最初，将新开发的血管化新生儿肾脏和猪胎儿排泄器官（包括胎儿肾脏、输尿管和膀胱）移植到同一受体猴子体内，并在本研究中验证了发育程度和免疫反应的差异。然后，将猪胎儿排泄器官移植到受体猴的主动脉和大网膜周围，并进行长期观察。因此，随着时间的推移，从病理学角度观察发育程度。

试验1：新生儿肾脏和胎儿排泄器官移植：根据Takamura等人描述的方法，进行新生猪肾脏血管吻合移植。实验计划的示意图如图1所示。在腹部中线切口后切断新生儿肾脏供体的血流。随后，在用465 mL Euro Collins溶液、35 mL 50%葡萄糖溶液和1000单位肝素组成的保存溶液回流后，将肾脏连同血管和输尿管一起取出。将其送到受体设施，为移植做准备（总储存时间为3小时）。

图1、实验计划的示意图。

所有受体猴子前一天晚上开始禁食直到手术。 在手术当天阿托品（0.1 mg·kg-1，肌肉注射（im））和氯胺酮（10 mg·kg-1，im）诱导麻醉后，使用异氟醚（0.5%–2%）吸入维持麻醉。术前术后使用布托啡诺（0.1 mg/kg, i.m.）作为镇痛剂，并使用每体47 500单位苄青霉素钾作为抗菌药物。在全身麻醉下，通过腹部中线切口对预处理的受体猴子进行剖腹手术。结扎左肾动脉/静脉和左输尿管后取出左肾；将猪新生肾置于原位，血管和输尿管吻合。然后将主动脉和左肾附近的腹膜后钝性剥落形成口袋，将两个排泄器官移植到每只动物的口袋中。移植后用LIGACLIP®闭合口袋。同样，将两个排泄器官移植到大网膜中，并用LIGACLIP®封闭囊袋。这防止了排泄器官脱落，因为排泄器官被网膜组织覆盖。将排泄器官移植到主动脉旁和大网膜后，关闭腹部和伤口，完成手术。

移植组织恢复：移植后13天通过腹部中线切口重新打开腹部。 剖腹手术后露出大网膜，以LIGACLIP®夹住的部分为导向识别移植的胎肾。将移植的胎儿肾脏的一部分连同周围的网膜组织一起解剖，以避免损伤，并回收组织。随后，人工移动肠道，露出移植的猪肾。剥离左肾动脉/静脉和左输尿管周围区域，暴露腹主动脉和下腔静脉。结扎左肾动脉后，结扎左肾静脉和左输尿管，在猪肾动静脉侧解剖移植肾，整体取出。最后将腹部和伤口缝合，手术完成。 术后继续给予免疫抑制剂，同时观察饮食摄入情况。此外，在移植27天后，用同样的方法再次鉴定移植到大网膜的剩余胎儿肾。胸腔内放血处死动物，回收移植组织，完成实验。

试验2：胎儿肾移植：受体猴术前、术后准备与实验1相似，全腹部聚维酮碘消毒，麻醉给药后沿腹中线切开。手动移动网膜和肠道以暴露腹膜后壁。主动脉和左肾附近的后腹膜被直接剥离，形成一个口袋，并将两个排泄器官移植到每只动物的口袋中。随后，在移植后用 LIGACLIP® 封闭口袋。 接下来，同样将三个排泄器官移植到网膜中，然后用 LIGACLIP® 封闭口袋。为了确保排泄器官不会脱落，排泄器官上覆盖了网膜组织。将排泄器官移植到主动脉旁和大网膜后，关闭腹部和伤口，完成手术。

大网膜胎儿肾回收/主动脉旁胎儿膀胱和泌尿道吻合：移植33天后，通过腹部中线切口重新打开腹部。剖腹手术后，以LIGACLIP®夹持的部分为指导，暴露大网膜，并确定整个移植的胎儿肾脏。然后将胎儿肾脏与周围的网膜组织一起解剖，以避免损伤，并恢复组织。同理，移植胎肾至主动脉旁区域后，剥离左肾动脉/静脉和左输尿管周围区域，暴露附近腹主动脉和下腔静脉。结扎左肾动脉后，结扎左肾静脉和左输尿管，取出左肾。切除后，通过端对端吻合其中一个胎儿膀胱和受体猴的左输尿管进行尿路重建。最后，在泌尿重建后，将腹部和伤口闭合，手术完成。

输尿管形成后主动脉旁胎儿肾的回收：移植后50或79天，通过腹部中线切口重新打开腹部。剖腹术后手动移动大网膜和肠道，并确定主动脉旁区域的移植组织。识别后结扎右肾动脉，从静脉输注约100 mL细胞外液（生理盐水、葡萄糖和VITAMEDIN®）以及呋塞米（20 mg）和靛蓝胭脂红（20 mg）。观察 > 15 分钟后，评估移植组织的尿液产生量。 随后，将移植的组织从周围组织中解剖出来并回收，完成了实验。

监测受体猴：如有必要，通过补充，确认并支持受体猴子的日常饮食状况和活动。此外，通过体重测量、体温、血氧饱和度测量和血液取样，每周对一般状况进行两次评估。除了 TAC 和 MMF，红细胞 (RBC)、血红蛋白 (Hb)、红细胞比容 (Ht)（平均红细胞体积 (MCV)、平均红细胞血红蛋白 (MCH) 和平均红细胞血红蛋白浓度 (MCHC)）、网织红细胞 ( RET)、白细胞 (WBC)（中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）、血小板 (Plt)、凝血酶原时间 (PT)、活化部分凝血活酶时间 (APTT)、空腹血糖 (Fbg)、总蛋白 (TP)、白蛋白 (Alb)、总胆红素 (T-Bil)、乳酸脱氢酶 (LDH)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、碱性磷酸酶 (ALP)、γ 谷氨酰转移酶 (γGTP)、肌酸激酶 (CK)、血尿素氮 (BUN)、肌酐 (Cr)、钠 (Na)、钾 (K)、氯 (Cl)、钙 (Ca)、磷 (P)、葡萄糖 (Glu)、总胆固醇 (T -Cho)、甘油三酯 (TG) 和 C 反应蛋白 (CRP) 也通过血液测试进行测量。

实验 1：胎儿肾脏对异种排斥反应的免疫学益处：根据一般情况和血液生化检测结果增加或减少免疫抑制剂的剂量。由此产生的药代动力学如图2所示。此外，在所有病例中，在开始服用免疫抑制剂药物后，观察到肝酶暂时增加。术后还观察到贫血。

图 2. 每只动物的血液检测数据。

一只受试猴在术后第7天因病情突然恶化而死亡。另一只受试猴相对比较稳定。然而，由于病情恶化和血小板转移，移植后13天，其腹部重新开放，以回收带血管的猪肾并进行排泄器官活检。与移植时相比，回收的肾脏明显肿胀（重量21-124克，最大直径5.2-10厘米），颜色也变为深红色，而排泄器官在视觉上保持不变。病理学评估显示组织大多被破坏。 虽然由于严重的间质出血和皮质坏死的影响，没有发现明显的肾小球、肾小管或肾小管周围的炎症表现，也观察到了伴有纤维蛋白血栓和管腔阻塞的严重动脉炎。 观察到大量被 HE 染色的多核细胞和 CD3 阳性细胞。同时回收的胎儿肾脏保留了几乎所有的组织结构，例如肾小球和肾小管。 此外，没有观察到核异常和CD3阳性细胞的浸润（图5（f）-（h））。

图 3、 实验 1 中移植的新生儿肾脏。 (a) 移植前； (b) 移植后 13 天。

图 4 、实验 1 移植的胎儿排泄器官。 (a) 移植后 13 天； (b) 移植后 27 天。

图 5、 比较实验 1 的新生儿肾脏和胎儿排泄器官组织病理学特征的代表图。

再次闭合腹部后，我们继续给同一只猴子服用免疫抑制剂。 移植后的猪肾切除后恢复，相对稳定，直至移植后27天死亡。图4显示了两个恢复的胎儿肾脏。移植后13天保存组织结构；局部可见CD3阳性细胞浸润。每个样本的Banff评分如表 3 所示。我们将动脉内膜炎排除在排泄器官评估之外，因为在移植的排泄器官中无法确认可评估的血管炎血管。在猪和猴中使用两种具有不同染色特性的CD31抗体来评估血管的存在。

图6、对实验1第27天排泄器官的血管进行评估。

实验 2：在 FDA 批准的免疫抑制药物下产生胎儿排泄器官：在组织移植约 4 周后的第 33 天进行尿路吻合术。 作为标准，移植组织最初计划在尿路吻合术后6周进行评估。然而，一只受试猴的情况在吻合术后逐渐恶化。因此，移植后 50 天取出移植组织后对其实施安乐死。 另一个受试猴相对更稳定。 因此，组织在吻合后 46 天（移植后 79 天）如期恢复。移植后 33 天，从网膜回收的最大胎儿肾脏的最长直径约为 800 µm。与实验 1 一样，大部分组织结构（如肾小球和肾小管）得以保留，并且未观察到细胞浸润。 移植后 50 天从主动脉旁区域恢复的最大胎儿肾脏的最长直径约为 1.5 毫米。此外，移植后79天从主动脉旁区域恢复的最大胎儿肾脏的最长直径约为2mm。

在切除组织之前，先穿刺胎儿膀胱。因此，在静脉注射靛蓝胭脂红给受试猴后，不能从任何地方吸出液体，也不能确认染料迁移到泌尿道。组织病理学评估未显示移植后 33、50 和 79 天胎儿肾脏中细胞浸润程度的任何显著变化。然而，肾小球似乎萎缩，鲍曼间隙增大，提示存在肾积水。对第50天收集的排泄器官RNA进行PCR。在食蟹猴EPO mRNA对应的引物中观察到RNA扩增，表明可能产生EPO。

图7、实验2移植胎儿排泄器官。

结论：这项研究证明了在不使用转基因动物的情况下，利用猪-猴临床前模型成功移植和长期植入胎儿肾脏。此外，这项研究对于开发注入人源性肾祖细胞的嵌合胎儿肾以实现人源性肾脏也很重要。

原文出自：In Vivo Development of Fetal Pig Kidneys in Mature Monkeys Under Clinically Approved Immunosuppressant Drugs - ScienceDirect