重组腺相关病毒（recombinant Adeno-associated virus，rAAV）是在腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）的基础上，通过工程改造得到的一种病毒载体，可在体内或体外中高效地递送外源基因，在基因治疗和科学研究等领域中得到广泛应用。早在1995年便有研究人员使用rAAV治疗囊性纤维化疾病。近年来，多款基于rAAV载体的基因治疗药物获得美国食品和药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准，用于治疗遗传性视网膜营养不良和脊髓性肌萎缩症。同时，在活体成像、神经环路标记、基因敲除、基因敲入和基因编辑等方向，rAAV载体的应用为广大科研人员实现基因操作等目的提供了便利。

虽然rAAV载体取得了一些成功，但是也面临较多的问题与挑战。比如包装容量较低、某些特定组织或细胞的靶向性不佳、部分血清型的产量较低等，都亟需解决。通过优化rAAV载体的设计和改造衣壳，科研人员逐渐找到解决上述难点的方法。下面给大家介绍rAAV载体的应用痛点和rAAV载体设计与衣壳优化改造的思路。    

一、rAAV载体的应用痛点

⭐ 包装载量低

rAAV一般只能装载5kb以下的基因片段，超出这个容量，rAAV的出毒量与活性往往大大降低。然而无论用于基因治疗的片段或科学研究上的基因长度，有不少被递送的基因片段大小大于5kb，这大大限制了我们的应用。

⭐ 体内预存免疫，降低rAAV有效性

现有的科研究已经证明，40%～80%的人有针对rAAV的中和抗体。由于体内预存免疫中和抗体的存在，rAAV侵染靶细胞的效率会受到限制。因此，目的片段的表达将会受到影响。

⭐ 组织靶向性不佳

针对某些细胞或组织，部分rAAV血清型的靶向性较差或没有合适的血清型。由于rAAV的吸附、入侵、胞内运输、蛋白酶体降解、入核、脱衣壳等步骤都与衣壳蛋白的结构相关，所以衣壳蛋白的结构是影响rAAV靶向特异性的一个重要因素。

⭐ 转导能力低、安全性风险高

部分rAAV血清型的转导能力低，往往需要较高剂量才能实现目的基因的递送。但会导致治疗基因在肝脏富集，产生肝毒性。而rAAV的转导能力是与衣壳蛋白高度相关。

⭐ 产量低，生产成本高

作为基因治疗药物，要求rAAV的滴度较高。对于系统性用药，还需要高剂量给药。但rAAV的产量低，且不同血清型的产量不同。这也是rAAV在基因治疗领域中的一个应用难点。已有研究表明，衣壳蛋白对rAAV产量有很大影响。     

二、rAAV载体设计和衣壳优化改造

⭐ rAAV载体设计优化

通过优化rAAV载体的设计，能在一定程度上扩大rAAV的装载容量、提高靶向性和降低免疫原性。对于长度过大的基因片段，可以利用rAAV基因组能通过ITR序列或重叠序列之间的同源重组连接成多联体的特性，将目的片段拆分成多个小片段，并包装成两个或多个rAAV病毒，这样便可以扩大递送片段的长度。

特异性启动子能使目的基因在特定的组织和细胞类型中表达，但一般而言特异性启动子的活性比CMV等广谱型病毒启动子的低。将特异性启动子与增强子序列结合，可提高特异性启动子的活性。例如，在hAAT启动子的基础上结合了肝脏特异性增强子ApoE，能有效提高目的基因在肝脏的表达水平。此外还可以缩短启动子的长度，以此扩大目的基因的装载容量。

还能通过在rAAV基因组的3‘UTR区引入组织特异性表达的miRNA的识别位点，可以有效降低目的基因脱靶的风险和降低免疫原性。比如引入肝脏特异性表达miRNA122a的结合位点，可有效降低肝脏中目的基因的表达。

⭐ rAAV衣壳优化改造

衣壳蛋白对rAAV的转导能力、靶向性、免疫原性和产量有着重要的影响，因此科研人员希望通过优化改造rAAV的衣壳蛋白，从而改善rAAV的适用性。现今，rAAV衣壳的优化改造有四种策略，分别是天然发现、理性设计、定向进化和计算机辅助的定向进化。

图1 获得新型rAAV血清型的主要方法^[6]     

现有常用的rAAV血清型大多是天然发现的，但种类较少，难以满足当今的研究需求。因此，不少研究人员从非人灵长类动物等分离出新型的rAAV血清型。但即使通过天然发现的方法，rAAV的种类仍然较少，并且存在前者的应用问题，因此仍需作进一步的优化改造。

针对常用的rAAV血清型，在分析其衣壳的结构、侵染过程、体内代谢等方面后，可以通过理性设计的策略改造衣壳，提高rAAV转导率和靶向特异性。常用的方法是在衣壳蛋白的特定位置进行插入和突变修饰。在rAAV衣壳上某些特定的位点插入多肽序列，插入的这些多肽序列不仅不影响rAAV包装和转染，还能特异识别特定细胞类型的表面抗原，从而提高rAAV的靶向特异性。例如在rAAV2的第587位点上插入表达靶向人内皮细胞的多肽序列，可有效提高rAAV2对人内皮细胞的靶向能力。此外通过定点突变，改善衣壳蛋白的结构，也能优化rAAV的功能。比如通过对rAAV2的衣壳进行多个位点突变，经过筛选有效突变，发现有多个突变型rAAV2的功能得到优化。主要体现在免疫中和抗体识别与中和突变型rAAV2的能力大大降低。通过理性设计策略可以有效优化rAAV的功能，但这种策略有较大的缺点，比如依赖科研人员的设计经验、成功概率低和只能发现有限的rAAV衣壳变体等。

定向进化策略可以很好地解决理性设计策略遇到的瓶颈。定向进化无需了解rAAV的作用机制、衣壳结构等背景，只需通过随机点突变、体外重组等方法构建高丰度的基因突变文库，再根据实际需求对文库给予筛选压力，经过迭代筛选，富集出目标的新型rAAV变体。应用定向进化的策略，已经筛选出较多的rAAV血清型，比如Tervo等得到了可在神经元内沿轴突逆向运输的突变图rAAV2-retro。虽然定向进化可以筛选到多种的血清型，但是这种策略技术门槛高、周期长和成本高，在一定程度上限制了血清型的改造。

对于定向进化遇到的瓶颈，“计算机辅助定向进化”是一个良好的思路和解决方案。特别是人工智能辅助rAAV衣壳蛋白设计的方式，具有高通量、成本低和周期短等优点。其大致的过程是通过构建大型的rAAV载体文库并包装成病毒，经过体内体外实验，并获得数据。将数据用于训练和优化AI模型。再根据实际需求（高滴度、特异靶向、低免疫原性等），用AI模型预测出合适的新型血清型。再经过体内体外的实验验证，判断新型血清型的有效性。AI预测模型能为衣壳蛋白的定向进化和理性设计提供参考，大大提高rAAV优化改造的成功率。

图2 基于AI的高效rAAV衣壳蛋白优化流程

来源：DYNO官网     

三、总结

rAAV在基因治疗和科学研究等领域有着广泛的应用前景，但面临诸如靶向性不佳、转导能力低、体内预存免疫等难题。虽然通过优化载体设计能在一定程度上得到解决，但开发新型血清型却能从根本上突破这些瓶颈。为了全面、有效、快捷、低成本地开发新型血清型，AI辅助定向进化这一策略提供了良好的思路。相信在不久的将来，越来越多的新型rAAV将会被发现，便于广大科研人员的研究和造福基因疾病的患者。        

四、参考文献

1. McLean JR, Smith GA, Rocha EM, et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 2014;576:73-78.

2. Greig JA, Wang Q, Reicherter AL, et al. Characterization of Adeno-Associated Viral Vector-Mediated Human Factor VIII Gene Therapy in Hemophilia A Mice. Hum Gene Ther. 2017;28(5):392-402.

3. Della Peruta M, Badar A, Rosales C, et al. Preferential targeting of disseminated liver tumors using a recombinant adeno-associated viral vector. Hum Gene Ther. 2015;26(2):94-103.

4. Lochrie MA, Tatsuno GP, Christie B, et al. Mutations on the external surfaces of adeno-associated virus type 2 capsids that affect transduction and neutralization. J Virol. 2006;80(2):821-834. 

5. Tervo DG, Hwang BY, Viswanathan S, et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 2016;92(2):372-382.

6. Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-378.

7. Akil O, Dyka F, Calvet C, et al. Dual AAV-mediated gene therapy restores hearing in a DFNB9 mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A.