牛视网膜可溶性抗原诱导大鼠葡萄膜视网膜炎模型
大鼠用牛视网膜可溶性抗原免疫后,大鼠免疫后第12~23d,可观察到葡萄膜视网膜炎症反应症状,免疫后23d,大部分均有光感受器外段破坏。
1.模型制作方法 Wistar大鼠,体重150g,雄性,健康无眼病。
(1)牛视网膜可溶性抗原(S-Ag)的提取:新鲜牛视网膜50只,匀浆、盐析、透析、离心,取上清液,使用二乙基胺乙基-琼脂糖凝胶,C柱(2.6cm×10.0cm),置4℃低温层析装置进行离子交换层析分离纯化S-Ag。装柱(填充约85ml凝胶),用pH7.5的含三羟基氨基甲烷的盐酸层析缓冲液流洗平衡凝胶柱后,加入牛视网膜上清液样品,继续层析缓冲液洗柱(流速50ml/h)至蛋白峰回落基线。0~0.4mol/L氯化钠线性洗脱,10个柱体积(100ml/h),每5ml收集1管(紫外线280nm监测)。S-Ag峰样品4℃双蒸水透析24h,移入玻璃瓶中,置-30℃保存。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色显示S-Ag为一主带,相对分子量为52×103。等电聚焦电泳S-Ag条带,等电点6.2,抗原分析结束后冻干,一30℃保存。
(2)大鼠葡萄膜视网膜炎模型的制作:将完全弗氏佐剂与等量牛视网膜S-Ag混匀,制成乳剂,S-Ag终浓度为1.35mg/ml,给大鼠双足底部各注射0.1ml,计270μg/只。前期实验分别用100μg,200μg、300μg S-Ag免疫大鼠诱发葡萄膜视网膜炎,经比较S-Ag 200~300μg为最佳免疫剂量。同时,每只大鼠尾静脉注射10×109个菌体的灭活百日咳杆菌溶液,腹腔注射0.1ml大肠杆菌超声粉碎离心后的上清液。造模23d后检查。
2.观察指标与分析 视网膜病理学检查,S-Ag免疫23d后,大鼠大部分均有光感受器外段破坏,正常梳状纹理消失,甚至光感受器外段变薄、消失。此外,炎症细胞浸润的种类、数量和部位、组织结构改变和破坏程度不等。其中,轻者视网膜内界膜增厚,炎症反应性均质样淀粉物质沉积或伴有局部空泡形成;神经节细胞和视网膜内丛状层空泡样变;视网膜色素上皮细胞肿胀、空泡样变性、结构紊乱;虹膜或睫状体充血,脉络膜增厚(类上皮细胞浸润),偶见炎症细胞浸润(主要为淋巴细胞)。中度者在上述改变基础上可见虹膜、睫状体或玻璃体腔内少量炎症细胞浸润;内界膜、内丛状层、内核层可见局限性炎症灶(炎症细胞聚集);脉络膜血管壁增厚,血管炎性反应。重度者在上述改变基础上,虹膜、睫状体、脉络膜和视网膜各层组织中炎症细胞浸润数量增多,玻璃体弥漫性炎症细胞渗出;有的眼脉络膜明显炎症性增厚,以淋巴细胞浸润为主;眼组织结构可见破坏。