摘要：大鼠被广泛用于研究眼部药物反应，而兔是眼部药物动力学最广泛的临床前模型。尽管它们广泛应用于玻璃体内注射药物的评价，但大鼠和兔之间缺少有关药代动力学和剂量比例的转化信息。在这项研究中，我们使用无创眼荧光光度法研究了大鼠和兔的玻璃体内药代动力学。将荧光素和不同分子量（376Da、10150和500kDa）的荧光标记分子葡聚糖注入兔和大鼠的玻璃体。确定化合物的玻璃体内浓度并计算药代动力学参数。总体而言，大鼠玻璃体内大分子的消除半衰期比兔短5-6倍，并且随着分子量的增加，半衰期延长。对于葡聚糖而言，兔与大鼠的玻璃体内清除率之比在2至5的范围内。 因此，暴露在兔中类似的药物的剂量需要比在大鼠中高2-5倍。同样，在转化为兔和人体研究中，必须考虑大分子在大鼠玻璃体中较短的半衰期。本文提出的比例因子将促进眼部疾病药物的转化开发。

关键词：玻璃体内  眼荧光光度法  药代动力学  种间转换 剂量比例

简介：由于大量患者患有视网膜疾病，因此将药物输送到后眼节很重要。目前，玻璃体内注射是治疗后眼节的临床确定方法。 玻璃体内注射抗VEGF抗体（贝伐单抗），Fab片段（雷珠单抗）和可溶性受体（阿帕西普）被广泛用于治疗与年龄相关的湿性黄斑变性。这些生物制剂在兔玻璃体内的半衰期约为4-5天，而小分子药物的消除半衰期通常不到10小时。在大多数的玻璃体内药代动力学研究中，大量的实验动物通常是兔，在不同的时间被处死以监测眼组织中的药物浓度。从伦理上讲这是有问题的，昂贵的，费力的，并且这种方法不能提供有关受试者间变异性的足够信息。眼部荧光光度法是一种非侵入性的体内光学技术，可测量眼部荧光标记分子发出的光。 例如，角膜，房水，晶状体和玻璃体。荧光光度法可以定量荧光化合物，从而可以对标记的大分子和药物递送系统进行眼药代动力学研究。荧光光度法已用于兔体内荧光标记的大分子的药代动力学实验。最近，Dickmann和他的同事使用荧光光度法和常规侵入法获得了玻璃体内雷珠单抗的类似药代动力学结果。尽管大鼠在临床前眼科药理学和毒理学中有着广泛的应用，但大鼠玻璃体内大分子的药代动力学尚未见报道。此外，在玻璃体内药物研发中，尚无数据支持大鼠至兔的剂量比例缩放。 缺乏大鼠研究是由于大鼠玻璃体的解剖和收集困难，因为大鼠玻璃体的平均体积约为50 µl。收集没有来自相邻组织的交叉污染的大鼠玻璃体非常困难。因此，许多大鼠动力学研究均使用全眼匀浆代替单个组织。最近，我们发现三种化合物（分子量范围为0.51-66.5 kDa）在小鼠玻璃体内的消除比在兔或人类中快得多。根据药代动力学参数，兔和人玻璃体内剂量应分别比小鼠高27-90和38-126。这项研究是通过无创SPECT / CT成像进行的，从而避免了解剖和交叉污染。我们之前还使用12种玻璃体内药物的动力学分析发表了兔到人转化的比例因子。人的玻璃体内药物剂量应该比兔高40%。在这项研究中，我们在大鼠和兔眼中研究了四种分子量为376-500000Da的玻璃体内化合物。根据眼荧光光度法的结果计算药代动力学参数，并进一步用于估计大鼠到兔和大鼠到人转化的比例因子。参数、比例因子和动力学模拟用于物种间转换的剂量指导。

材料与动物：将平均分子量为10 kDa，150 kDa和500 kDa的异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖溶解在无菌盐水中。在大鼠实验中，FITC-葡聚糖玻璃体腔注射浓度为5mg/ml（500kda）或10mg/ml（10kDa和150kDa）。在兔研究中，FITC葡聚糖浓度为5 mg/ml，荧光素钠（2µg/ml）。所有溶液在用于动物实验前均应现配现用。 使用注射器过滤器过滤溶液，孔径为0.2 µm。动物：使用300-400g、2-6月龄的Lister远交雄性大鼠。用于荧光素注射的荷兰兔（平均6月龄，体重2.7-4.0kg）。平均6月龄、体重3.0～3.5kg的大白兔用于FITC葡聚糖注射。

大鼠荧光光度法：在异氟烷麻醉下对大鼠的眼睛进行玻璃体内注射。去氧肾上腺素（100 mg / ml）和托吡卡胺（5 mg / ml）用于最大瞳孔扩张  。在玻璃体内注射之前，局部应用盐酸奥布卡因（4 mg/ml）对眼表进行麻醉。在玻璃体内注射之前，局部用美托咪定（10 µl； 1 mg / ml）抑制了异氟烷麻醉引起的可能的眼球运动。玻璃体腔内注射用眼科手术显微镜监测和控制。将针头（34 G）穿过巩膜（距角膜缘约1 mm）插入玻璃体，每只眼注射3µl溶液。注射每只动物的两只眼睛。 注射后，应用局部水凝胶以防止角膜干燥。注射后，用光学相干断层扫描和眼底照相机检查眼睛是否有晶状体和视网膜损伤。损伤的眼睛被排除在动力学测量之外。在异氟烷麻醉下使用Fluorotron Master荧光光度计进行荧光光度法。在每次扫描前约10分钟，用局部去氧肾上腺素和托吡卡胺联合散瞳。此外，10µl美托咪定局部用作局部肌肉松弛剂，以避免荧光光度测量期间的任何眼球运动。设计所有测试化合物的注射剂量，以使所有测得的信号均在线性检测范围内。

兔荧光光度法：氯胺酮（25mg/kg）和美托咪定（0.5mg/kg）联用麻醉家兔。用5mg/ml托吡卡胺溶液局部扩张瞳孔。局部应用盐酸奥布卡因（4 mg / ml）进行眼表局部麻醉。使用31 G针和垂直于巩膜表面的100 µl Hamilton注射器对超颞象限（手术角膜缘后4.5 mm）进行玻璃体内注射（每只眼40 µl）。注射后，应用局部水凝胶（Viscotear）以防止角膜干燥。 在大分子的情况下，在每只动物中注射两只眼睛。 对于荧光素，仅注射一只眼睛以最大程度地减少全身暴露。每次荧光光度测量，通过皮下美托咪定（0.5 mg / kg）对兔进行轻度镇静。测量前20分钟，用托吡卡酰胺滴眼液局部扩张瞳孔。在FITC葡聚糖清除缓慢的情况下，皮下注射阿替美唑（1mg/kg）唤醒家兔。在荧光素实验中，美托咪定（0.5 mg / kg）和氯胺酮（25 mg / kg）联合使用用于兔连续麻醉。皮下注射等渗0.9%生理盐水，防止麻醉家兔脱水。在兔研究中使用了Fluorotron Master的玻璃体适配器（轴向分辨率为0.25 mm）。

荧光信号分析：在玻璃体内注射之前进行基线测量以确定自身荧光水平。 从测得的荧光中减去自发荧光以获得玻璃体内注射的荧光化合物的净信号。在玻璃体前后轴上测量信号。对于兔，玻璃体内的平均信号是从视网膜前方3mm处获得的。对于大鼠，玻璃体直径≈1.4 mm，使用玻璃体中部的最大信号强度。将每个时间点的净信号转换为玻璃体内浓度。 在pH 7.3的磷酸盐缓冲液中制备每种荧光化合物的校准溶液，以模拟玻璃体pH。利用信号与浓度的关系推导出校准方程。将溶液置于比色杯中，并用Fluorotron记录信号。对于荧光素，预校准仪器报告实际浓度，不需要校准溶液。获得了随时间变化的玻璃体化合物浓度，并用于动力学计算。PKSolver软件用于估计一级消除动力学一室模型的药代动力学参数（表观分布容积、消除半衰期、清除率）。

结果：大鼠和兔的校准和荧光光度扫描：荧光信号与化合物浓度在很宽的浓度范围内呈线性关系。作为示例，在图2中显示了在不同时间点注射10 kDa FITC-葡聚糖后一只大鼠和一只兔眼的荧光光度扫描。该图显示了大鼠和兔眼玻璃体和前部（角膜、前房）荧光水平随时间的下降。

图1、荧光化合物的浓度与荧光信号的线性范围。

图2、向大鼠（a）和兔（B）玻璃体内注射FITC葡聚糖10 kDa之前（自体荧光）和之后的荧光光度扫描示例。颜色表示注射后扫描的不同时间。

大鼠玻璃体内药代动力学研究：大鼠玻璃体内FITC-右旋糖酐（10、150和500 kDa）的对数线性浓度与时间的关系曲线如图3所示。每条拟合线显示了一只眼睛的一级消除曲线。表观分布容积比大鼠玻璃体解剖体积（≈50 µl）略高（平均73-186 µl）。平均消除半衰期为13-34 h，清除率为2.1-4.5 µl / h。随着平均分子量的增加，清除率降低。荧光素的消除半衰期短（1h）是由于其低分子量和在视网膜色素上皮的主动转运所致。

图3、大鼠单次玻璃体腔注射后的浓度-时间曲线。

对数线性图显示玻璃体内化合物的消除遵循一级动力学。每条拟合线显示一只眼睛的消除曲线。消除半衰期的范围从几个小时（荧光素）到大约一周（FITC葡聚糖157和500 kDa）。表观分布容积（1.2～2.6ml）在兔玻璃体解剖容积范围内（≈1.7ml）。FITC-葡聚糖500 kDa的平均消除半衰期和清除率分别为FITC-葡聚糖10 kDa的183％和27％。文献中获得的FITC-葡聚糖157kda（166h）的消除半衰期与本研究中的FITC-葡聚糖500kda（152h）相似。

图4、玻璃体内注射的浓度-时间曲线。A）荧光素，B）FITC-葡聚糖10kDa和C）FITC-葡聚糖500kDa

大鼠-兔剂量比例因子: 大鼠和家兔玻璃体内化合物的半衰期和清除率均随化合物分子量的增加而改变。玻璃体下的曲线下面积（AUC）描述了总的药物暴露，并且与玻璃体内清除率呈负相关（AUC =剂量/ CL）。因此，将兔和大鼠中相等药物暴露（AUC）的剂量比例因子定义为D兔 / D鼠=（CL兔 / CL鼠）。荧光素的大鼠-兔比例因子为8.3，而FITC-葡聚糖的大分子比例因子范围为1.9-4.9。

结论：总的来说，这项研究的结果显示大鼠的玻璃体清除速度比兔快。药物在兔眼的维持时间较长，但清除率高于大鼠眼。对于玻璃体内大分子，大鼠到兔的剂量比例因子为2-5。这为眼科药物发现和开发过程中的药理和毒理学研究设计提供了有用的转化信息。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0928098721000221