斑马鱼在宿主-病原体相互作用领域相对较新，尽管几十年来它们一直是发育生物学和神经科学中有价值的脊椎动物模型。透明斑马鱼仔鱼具有人类先天免疫系统的大部分成分，成年斑马鱼也产生适应性免疫系统的细胞。利用斑马鱼感染模型的最新发现包括病原体存活机制和微生物的宿主细胞感应。这些发现得益于斑马鱼技术，该技术不断发展并为免疫生物学研究提供了新的机会。工具包括 CRISPR/Cas9 突变、体内生物素化和基因编码生物传感器。 我们认为斑马鱼模型——在免疫学中仍未得到充分利用。

斑马鱼模型的优点：斑马鱼已被广泛用于模拟人类发育和疾病，包括遗传疾病如囊性纤维化、神经退行性疾病如阿尔茨海默病和几种癌症。斑马鱼基因组包含71%的人类基因的同源序列。此外，斑马鱼本质上具有许多使其成为理想模型宿主的特征，例如胚胎的快速外部发育、2-3个月的短性成熟时间以及产卵多。雌性斑马鱼每周产卵约 300 个，使高通量实验能够比较数百个卵。通过卵内注射可以进行高效的基因组编辑。此外，斑马鱼胚胎和仔鱼是光学透明的，一些转基因品系的成鱼也是如此。这允许在完整动物体内进行高分辨率活体成像和延时成像实验。使用长距离物镜和共焦显微镜，可以对仔鱼体内的任何部位进行成像。为了模拟传染病，人类病原体或鱼类的天然病原体可以感染斑马鱼仔鱼或成虫。斑马鱼工具，包括基因编辑和表达荧光蛋白的转基因系可以与感兴趣的感染模型结合使用。在本文中，我们研究了斑马鱼在宿主微生物研究中的应用，重点是仔鱼感染模型。 我们首先比较斑马鱼和人类的免疫系统。然后，我们讨论了利用斑马鱼进行宿主病原体研究，包括在病原体的细胞感应、免疫细胞反应和病原体生存策略方面的发现。最后，我们评估了最近可能被修改用于宿主病原体研究的斑马鱼工具。这些数据表明，斑马鱼技术可以为感染生物学提供强有力的见解。

图 1.斑马鱼感染实验。

斑马鱼与人类免疫系统的相似性：斑马鱼和人类的免疫系统非常相似。 仔鱼（受精后 1-2 周）可用于单独研究先天免疫系统，而适应性免疫系统在受精后 4-6 周发育。斑马鱼拥有先天免疫细胞类型，例如巨噬细胞和粒细胞，它们在功能上类似于它们的哺乳动物对应物。 例如，斑马鱼巨噬细胞参与吞噬作用，产生促炎和抗炎细胞因子并形成肉芽肿。斑马鱼有两种主要类型的粒细胞：中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。斑马鱼中性粒细胞能够吞噬、呼吸爆发和产生中性粒细胞胞外陷阱。斑马鱼体内的嗜酸性粒细胞对寄生蠕虫有反应，就像人类一样。在体外，斑马鱼嗜酸性粒细胞在暴露于啮齿动物病原体多形螺旋线虫后会脱粒，并在斑马鱼病原体毛细线虫感染时增加肠道中的嗜酸性粒细胞数量。斑马鱼中肥大细胞在形态上与人类相似。斑马鱼和人类肥大细胞的功能相似，包括脱颗粒和参与全身过敏反应，通过血浆类胰蛋白酶浓度来测定。鉴于这些相似性，斑马鱼感染中的宿主微生物发现通常可以进行临床转化，特别是在斑马鱼-海分枝杆菌结核病 (TB) 模型中。例如，与人类结核病易感性相关的斑马鱼基因 lta4h 在斑马鱼遗传筛选中成为 M. marinum 的易感基因位点。人类和斑马鱼之间的免疫学相似性使斑马鱼工具能够应用于解决患者传染病的特定问题。斑马鱼具有保守的先天免疫受体，包括 Toll 样受体 (TLR)。大多数斑马鱼TLR及其适配器的功能与人类相似。在斑马鱼中发现的 TLR 转接分子包括髓样分化因子 88 (Myd88)、Mal2和不育 α 和 HEAT-Armadillo 基序 (Sarm1)。一种抑制Myd88翻译的吗啉代寡聚体被发现会损害正常非致病性肠道沙门氏菌菌株的清除。这表明了TLR信号在斑马鱼中的功能作用。事实上，斑马鱼和人类TLR对类似的病原体相关分子模式（PAMP）有反应，如双链RNA（dsRNA）和鞭毛蛋白。在模式识别受体 (PRR) 的下游，斑马鱼拥有保守的信号通路，包括核因子 κB (NF-κB) 和 I 型和 II 型干扰素 (IFN)。此外，斑马鱼通过环状 GMP-AMP 合酶 (cGAS)具有保守的胞质 DNA 传感途径。 在斑马鱼中，与在人类中一样，cGAS 会激活干扰素基因 (STING) 刺激物，从而介导 I 型 IFN 的产生。然而，斑马鱼 STING 的 C 末端尾部带有一个额外的基序，与人类 STING 相比，它导致更强的 NF-κB 激活和更弱的干扰素调节 3 (IRF3) 信号传导。此外，大多数人类趋化因子受体至少有一个斑马鱼同源基因，并且功能保守。然而，一些趋化因子及其受体，如CXCL12和CXCR3，在斑马鱼中具有额外的功能差异的副作用。尽管存在一些差异，但大多数免疫细胞类型和信号通路的保守性为在斑马鱼中模拟人类感染奠定了基础。

使用斑马鱼了解微生物的细胞自主感知：已在斑马鱼中检查了 TLR 下游的 Myd88 信号传导在免疫细胞反应中的作用。小鼠试验显示通过Myd88的TLR信号对结核分枝杆菌的免疫反应很重要。类似地，Myd88信号有助于斑马鱼宿主对海洋分枝杆菌的反应，从而导致结核病样疾病。事实上，在 M. marinum 感染的斑马鱼胚胎中缺乏功能性 Myd88，细菌负荷增加。为了了解 Myd88 在真菌感染中的作用，烟曲霉感染了myd88 突变体仔鱼，并且比野生型仔鱼更容易受到感染。此外，一项比较无菌仔鱼和常规仔鱼的研究表明，微生物的肠道定植降低了 myd88 和下游信号成分的表达，例如激活蛋白 1 (AP-1) 转录复合物。在野生型斑马鱼中观察到的 myd88 表达降低在 tlr2 突变体仔鱼中不存在，表明对 Myd88 的影响是 Tlr2 介导的。总的来说，这些研究表明斑马鱼已经成为检查细胞如何感知微生物的有用工具。已在斑马鱼中探索了极化先天免疫细胞（如巨噬细胞）的信号通路。

使用双转基因斑马鱼观察分化的巨噬细胞，该斑马鱼表达来自 tnfa 启动子的 eGFP 和来自巨噬细胞特异性启动子 mpeg1 的 dsRed。共聚焦显微镜鉴定了tnfa+mpeg1+巨噬细胞，对应于对大肠杆菌感染作出反应的促炎性巨噬细胞。此外，为了了解斑马鱼体内的巨噬细胞极化，利用RNA-seq来确定肉芽肿内经历2型信号传导的巨噬细胞亚群。具体来说，这些信号对于巨噬细胞上皮化（由 E-钙粘蛋白免疫染色确定）和坏死性肉芽肿形成（由 l-plastin 白细胞免疫染色和荧光标记细菌可视化）是必需的。此外，在由麻风分枝杆菌引起的麻风斑马鱼模型中，感染增加了诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 阳性巨噬细胞的数量。在这个模型中，缺乏巨噬细胞的仔鱼的髓鞘损伤比野生型对照组少，表明巨噬细胞介导早期脱髓鞘。在感染真核寄生虫锥虫的仔鱼中发现了另一种类型的促炎巨噬细胞，泡沫巨噬细胞。在感染的仔鱼中，通过高脂含量和促炎基因如tnfa和il1b的表达来鉴定泡沫状巨噬细胞。这项研究表明泡沫状巨噬细胞在细胞外锥虫感染中具有潜在的炎症作用，泡沫状巨噬细胞常见于炎症代谢紊乱，如高脂血症。这些例子证明了斑马鱼转基因和转录组学在定义细胞如何对体内微生物作出反应方面的贡献。

利用斑马鱼了解病原体生存策略：斑马鱼已被用于了解病原体如何在宿主中传播和生存。例如，斑马鱼研究揭示了巨噬细胞在 M. marinum 感染期间肉芽肿内的复杂作用。虽然巨噬细胞在控制细菌数量方面很重要，但受感染的巨噬细胞可以将海洋分枝杆菌传播到更深的组织中。斑马鱼活体共聚焦显微镜观察显示，感染的巨噬细胞留下肉芽肿并继发肉芽肿。类似的过程被认为发生在小鼠身上。斑马鱼真菌感染模型表明，受感染的巨噬细胞可以保护病原体 Talaromyces marneffei 和 A. fumigatus 免受中性粒细胞介导的杀伤，因为巨噬细胞耗竭时观察到真菌负担减少。这些发现对Talaromyces marneffei 和 A. fumigatus感染的宿主导向治疗具有指导意义。一些病原体可以通过转移到更有利的细胞类型来促进感染的传播。例如，海洋分枝杆菌可以从常驻的巨噬细胞逃逸到生长能力更强的单核细胞。共聚焦显微镜能够显示巨噬细胞-单核细胞的聚集，分离两个细胞，然后在单核细胞中出现细菌。此外，这种向单核细胞的转移依赖于海洋分枝杆菌上的表面糖脂酚糖脂 (PGL)。此外，一些真菌病原体可以利用细胞间交换转移到新细胞而不暴露于环境中。斑马鱼试验在 T. marneffei 和 A. fumigatus 中发现了一种新的过程，称为“穿梭”，这是通过共聚焦显微镜观察到的。穿梭是将真菌孢子或分生孢子从活的中性粒细胞转移到活的巨噬细胞。这一过程是由β-葡聚糖介导的，β-葡聚糖是真菌细胞壁的一种多糖成分。穿梭使病原体能够从杀真菌的中性粒细胞转移到允许生长的巨噬细胞。此外，荧光标记的酵母聚糖已在体外从鼠中性粒细胞转移到巨噬细胞，这表明穿梭可能是脊椎动物中的一个保守过程。事实上，关于细胞间病原体交换的研究扩大了我们对病原体如何在复杂多细胞环境中穿梭的理解。这些研究进一步证明，病原体依赖因子可以介导吞噬细胞与吞噬细胞之间的相互作用。

使用斑马鱼工具研究宿主-病原体相互作用：基因编辑：斑马鱼的最新基因、转录组学和成像技术可用于推进宿主-病原体研究。CRISRP/Cas9是一种基因编辑工具，可以快速产生稳定的敲除或敲入斑马鱼品系。CRISPR/Cas9 已用于斑马鱼感染模型； 例如， stat6 突变体被用来证明 2 型信号在肉芽肿形成中的作用。可以通过从细胞特异性启动子表达Cas9来实现细胞类型特异性突变。CRISPR 技术可用于快速反向遗传筛选。快速反向遗传筛选虽然在哺乳动物中不可行，但由于其产卵量大和 CRISRP/Cas9 基因组编辑的高效率，在斑马鱼中是可能的。反向遗传筛选提供了一种发现对感染重要的宿主因素的公正方法，同时提供了一种将基因与其相关突变表型联系起来的简化方法。虽然基于CRISPR的反向遗传筛选在斑马鱼中相对较新，但一段时间以来，正向基因筛查一直是一种成功的高通量方法。例如，在斑马鱼-海洋分枝杆菌模型中，正向遗传筛查确定了人类结核病共有的易感位点，包括lta4h。这些基因工具与斑马鱼感染模型相结合，有望发现对感染重要的新宿主因素。

荧光转基因系：其他方法包括荧光转基因系，当与活体成像相结合时，它是斑马鱼的有力工具。标记特定细胞类型的转基因荧光斑马鱼系通常用于研究免疫细胞行为和迁移。转基因动物可以感染荧光标记的微生物，以观察病原体和宿主细胞之间的接触。 例如，可以在带有标记的血管和巨噬细胞的转基因斑马鱼中观察到荧光 M. marinum。ISG15:GFP 转基因斑马鱼系在干扰素刺激的基因 15 (isg15) 启动子下表达 GFP，以实现 I 型 IFN 信号的实时成像。光转换荧光团，如Dendra2，可以通过共聚焦显微镜局部应用光，在特定位置跟踪细胞。例如，Dendra2 在中性粒细胞中表达，在缺乏髓源性生长因子 (MYDGF) 的仔鱼中进行细胞追踪。中性粒细胞在伤口部位被光转换以标记对损伤有反应的细胞。追踪特定细胞是斑马鱼的一个独特特征，有望促进我们对免疫细胞迁移的理解。

图2：海洋分枝杆菌感染斑马鱼仔鱼的全脑共聚焦图像。

在本文中，我们认为斑马鱼的许多实验优势使该模型成为研究宿主-病原体相互作用的理想系统。我们提供了一些例子来说明利用斑马鱼进行宿主病原体研究所取得的广泛发现。因此，在斑马鱼中使用成像、遗传、生物传感器和转录组学工具可以为传染病发病机制提供新的见解。与生物医学中使用的所有模型系统一样，研究结果必须在人体细胞或临床环境中得到证实。必须考虑斑马鱼和人类免疫系统之间的差异，例如基因复制和趋化因子受体的分歧，才能使结果有意义。尽管这些差异在某些情况下可能会使研究结果的可转化性复杂化，但它们也可以用来理解宿主-病原体相互作用中的进化保守性。斑马鱼模型的另一个限制是斑马鱼特异性抗体的可用性有限。这阻碍了免疫荧光或免疫印迹的使用，尽管遗传方法通常已经足够了。斑马鱼的未来研究对于扩大我们对导致人类疾病的病原体的了解非常重要，尤其是对治疗有限、预后不良和有害副作用的感染。此外，斑马鱼还可以作为一种有用的临床前模型，通过化合物筛选来寻找传染病的新候选疗法。斑马鱼具有简单的基因，能够在免疫系统与人类相似的透明脊椎动物中进行高通量实验和实时成像。随着技术的不断进步，斑马鱼感染模型可用于了解新出现的病原体以及对抗菌剂产生更强耐药性的传染病。

原文出自：Zebrafish: an underutilized tool for discovery in host–microbe interactions - ScienceDirect