研究人员在本次研究中使用了CIRKIL转基因小鼠和基因敲除小鼠（其中CIRKIL转基因小鼠和基因敲除小鼠由赛业生物构建），建立了心肌缺血/再灌注模型。他们采用RNA pull-down和RNA免疫沉淀分析来检测CIRKIL与Ku70之间的相互作用。 

DNA双链断裂（DSB）可通过激活DNA损伤反应通路诱发严重的心肌病。Ku70蛋白是DNA损伤修复的重要调控因子，但其在心脏I/R损伤中的作用仍不清楚。研究团队之前发现一种高度保守的lncRNA在心肌梗死中上调，于是他们想了解这种称为CIRKIL的lncRNA如何调控心脏I/R损伤。 

研究人员首先通过体内和体外分析发现在I/R心脏和H2O2处理的心肌细胞中CIRKIL的表达增加。为了弄清CIRKIL在心脏I/R损伤中的作用，他们使用了过表达CIRKIL的转基因小鼠（其中过表达CIRKIL转基因小鼠由赛业生物构建）。与对照相比，过表达CIRKIL加重了I/R小鼠的心脏功能障碍，具体表现为扩大了梗死面积，并加重了心肌细胞损伤。同时，在CIRKIL敲除小鼠上开展的实验表明，CIRKIL的敲除可减少心肌梗死面积，降低心肌细胞凋亡，并减轻心肌I/R损伤。 

lncRNA可以通过与特定的蛋白伴侣结合来调节基因表达和发挥生物学功能。于是，研究人员采用RNA pull-down分析鉴定CIRKIL的潜在结合蛋白。实验结果中包含Ku70，该蛋白是细胞核中参与DNA损伤修复的关键分子。那么，CIRKIL在I/R损伤和H2O2诱导的损伤中的有害作用是不是是通过Ku70介导的呢？ 

他们开展了RNA pull-down实验和Western blot实验，结果证实CIRKIL与Ku70蛋白之间确实存在相互作用（图1）。CIRKIL的敲除增加了Ku70在细胞核内的分布，而CIRKIL的过表达阻止了Ku70在心肌细胞中的核易位，这表明CIRKIL与Ku70的结合干扰了Ku70的核易位。 

图1. CIRKIL与Ku70相互作用并抑制Ku70的核易位

3.Ku70介导了CIRKIL对心脏损伤的影响 

之后，研究人员通过功能获得和功能缺失两种方法研究了Ku70对心肌细胞损伤的影响。结果表明，Ku70的敲低显著加重了H2O2诱导的心肌细胞损伤，而且组蛋白H2A.X（γH2A.X）的水平进一步增加，γH2A.X是DNA双链断裂的特异性标志物。同时，Ku70过表达有效减轻了H2O2诱导的心肌细胞损伤。这些数据表明，Ku70在心脏I/R损伤中扮演保护角色。 

接下来，研究人员探讨了Ku70是否介导CIRKIL对心脏损伤的影响。他们通过测定组蛋白H2A.X（γH2A.X）的水平来评估CIRKIL的过表达或敲除是否影响DNA双链断裂修复。CIRKIL的过表达增加了γH2A.X的表达，而CIRKIL的敲除引起了相反的变化，该结果表明CIRKIL可以调控双链断裂修复。 

Ku70的过表达阻止了CIRKIL过表达对心肌细胞活力的抑制作用，消除了γH2A.X的上调并引起心肌细胞凋亡。以上的数据表明，CIRKIL对心脏I/R损伤的有害影响是通过抑制Ku70核易位实现的（图2）。研究人员还确定，CIRKIL上的1030-1130 nt序列是其功能结构域，该结构域负责CIRKIL与Ku70的结合。

图2. CIRKIL调控心脏损伤的示意图 

在这项研究中，研究人员首次发现CIRKIL通过与Ku70相互作用而加剧心肌I/R损伤。它通过抑制Ku70的核易位和破坏双链断裂修复来促进细胞凋亡。这些结果揭示了lncRNA在心脏I/R损伤中的作用，还提示CIRKIL和Ku70这两个位点有可能成为预防和治疗心脏I/R损伤的新靶点。  

小鼠快速繁育服务 

体外受精（in vitro fertilization, IVF）是快速繁育的一环，它能帮助科研人员在更短的周期内得到更多的阳性鼠，且保证了出生小鼠周龄的一致性，降低了由于小鼠周龄差异导致的实验误差。