摘要：肾脏在体液平衡和废物排泄中起着至关重要的作用，肾损伤可对人类的健康和生存造成严重影响。大多数化学品，肾毒性潜力和相关机制尚不清楚。因此，需要对肾毒性化学品进行快速和灵敏的筛查。在文献综述的基础上，评估了斑马鱼在化学诱导肾毒性和相关毒性模式研究中的效用。斑马鱼具有广为人知的生物学特性，以及许多与哺乳动物重叠的生理特征。 其中一个特征是其肾脏，其组织学和功能与哺乳动物相似，但应注意斑马鱼肾脏的独特差异，例如肾骨髓。此外，斑马鱼肾结构更简单，易于观察。由于这些优势，斑马鱼越来越多地被用作筛选化学品肾毒性和了解相关机制的实验模型。斑马鱼模型的多个终点，从功能水平（即肾小球滤过）到关键基因的转录变化已被评估以确定化学诱导的肾脏毒性并阐明潜在的机制。斑马鱼化学诱导肾毒性的最常见研究机制包括氧化应激、炎症、DNA损伤、凋亡、纤维化和细胞死亡。迄今为止，已证明几种药物、氧化剂、天然产物、杀菌剂、酒精和消费化学品对斑马鱼产生不同类型的肾脏毒性。本综述表明斑马鱼模型可以有效地用于快速可靠地评估化学品的肾脏损伤潜力以及相关的毒性机制。从该模型获得的毒理学信息可用于鉴定肾毒性化学品，从而保护公众健康。

关键词：肾毒性  斑马鱼  高通量  筛选 化学品安全

摘要：肾脏是负责维持体液内稳态和排泄包括人类在内的脊椎动物体内废物的重要器官。肾脏疾病和化学品：肾脏疾病会严重威胁人类的福祉和生存，因此被认为是重大的公共卫生问题之一。急性肾损伤（AKI）是一种以肾小球滤过率（GFR）突然下降或血清肌酐水平升高为特征的急性疾病。肾灌注障碍或减少、肾小球肾炎或毒素（如抗生素和几种化学物质）可能导致急性肾损伤。另一方面，慢性肾病（CKD）被定义为肾功能逐渐退化，最终导致肾功能衰竭。CKD是普通人群中普遍存在的慢性疾病。流行病学证据越来越多地支持化学物质参与急性和慢性肾脏疾病的发生和进展。食用受三聚氰胺污染的牛奶的儿童患上肾结石，其中2.5%的儿童随后成为急性肾功能衰竭的受害者。三聚氰胺及其代谢产物三聚氰酸对肾脏的特征性损害已在其他几项流行病学研究中得到进一步验证。体内试验也用于肾毒性评估，大多数体内方法涉及啮齿动物模型，包括啮齿动物的重复28 天经口毒性研究。可用于高通量筛选肾毒性的标准化测试方法是有限的。由于斑马鱼肾脏易于观察并且具有与哺乳动物非常相似的生理特征，因此斑马鱼已被建议作为一种替代实验模型用于快速可靠地筛选肾毒性化学物质及了解相关机制。例如，可以很容易地观察到斑马鱼胚胎幼体的前肾结构或功能变化，因此可以用于快速可靠地评估化学诱导的肾毒性。另一方面，成年斑马鱼的中肾结构更复杂，已被用于药物或化学物质引起的肾毒性的机理研究。

用于肾毒性评估的斑马鱼模型：作为淡水鱼，维持液体渗透压对斑马鱼的生存至关重要。在斑马鱼胚胎发生过程中，前肾发育在受精后约 48 小时 (hpf) 完成。中肾在幼年阶段逐渐发育。斑马鱼的肾脏比人类的肾脏结构简单。与人类相似，斑马鱼的肾脏包含肾小球、颈部、近端小管、远端小管和集合管。在幼龄斑马鱼中，前肾是能够调节渗透压的功能性肾脏。.前肾由两个肾单位组成，前肾管与哺乳动物的近端和早期远端小管相当。与哺乳动物不同，斑马鱼的前肾没有细支和粗上升支结构。成年斑马鱼具有中肾结构，但与人类不同，它不会发育成后肾。斑马鱼的肾脏与哺乳动物的肾脏有几个明显的不同：斑马鱼和所有硬骨鱼类一样，缺乏骨髓和淋巴结，其造血发生在肾骨髓中，肾骨髓的功能相当于哺乳动物的骨髓。斑马鱼肾脏损伤也会影响免疫功能。此外，斑马鱼的肾脏在受伤后可以再生。这与哺乳动物肾脏不同，后者的损伤通常被认为是不可逆转的。 当斑马鱼用作肾毒性模型生物以推断或转化人类结果时应仔细考虑这些特征差异。尽管存在这些差异，斑马鱼作为肾脏毒理学实验模型具有几个独特的优势。 肾功能相似是斑马鱼最重要的优势之一。：肾小球过滤血液，肾小管段排泄或重吸收溶质和水，集合管将尿液排出体外。与人类和其他哺乳动物相比，斑马鱼肾脏的肾单位片段模式和细胞组成更容易获得和观察。此外，随着对替代试验方法的需求增加，胚胎-仔鱼斑马鱼模型被认为是一种有用的模型，可以补充现有的体外实验模型。胚胎期和幼体期斑马鱼被认为是一种快速肾毒性评估筛选模型。成年斑马鱼被认为对机制研究更有用，更容易获得器官或组织特异性反应。此外，斑马鱼导致肾脏毒性的主要途径的基因，例如细胞凋亡、氧化应激和炎症，以与人类相似的方式表达。斑马鱼已被用作评估化学诱导肾毒性的实验模型。根据文献综述，评估了斑马鱼在研究化学性肾毒性和研究毒性模式方面的效用。

肾毒性评估的观察终点：为了评估化学诱导的肾脏毒性和相关机制，许多观察终点已应用于斑马鱼模型。这些可以根据生物学水平（如功能、组织学、分子、蛋白质和基因）的观察终点进行分类。

图 1. 斑马鱼不同生命阶段测量到的化学性肾损伤。胚胎、仔鱼和成年斑马鱼暴露于化学品后的形态、功能、组织学、细胞、分子或转录水平变化。

肾脏滤过功能改变：滤过是肾脏在肾小球中的一项基本功能，已被用于评估肾脏的功能损害。采用了直接和间接方法测量斑马鱼肾小球滤过的变化。直接测量包括测量肾清除的标志物。标记间隙减小被认为是滤过功能受损。荧光标记的葡聚糖或菊糖是最常用的标记物质。将这些标记物微量注射到斑马鱼心脏，并随时间推移通过荧光显微镜量化标记物的肾脏清除率。许多研究中使用了不同的标记：异硫氰酸荧光素（FITC）标记的右旋糖酐用于测量肾小球滤过强度。罗丹明标记的葡聚糖方法用于测量肾小球滤过强度。斑马鱼模型使用直接方法测量的过滤功能改变提供了化学诱导的肾脏毒性的直接指示。直接测量功能变化需要熟练的操作，例如，将荧光物质微量注射到非常微小的斑马鱼胚胎或幼体中。如果仔细应用，幼鱼可用于高通量筛选。将斑马鱼的观察结果转化为人类结果应考虑斑马鱼和哺乳动物肾脏之间的结构差异，例如缺少细支段、粗升支和膀胱。由于结构差异可能导致功能差异，因此可能需要额外的证据来将斑马鱼的观察结果与哺乳动物的潜在肾脏结果联系起来。，尿液中排出的过量蛋白质已被作为肾功能的间接测量。因为大分子如蛋白质的存在可能表明肾小球不能过滤和维持循环中的大分子。通过量化暴露后水中的蛋白质间接测量斑马鱼的蛋白尿。该方法的有效性可能会受到介质潜在外部污染的挑战，例如饲料或排泄物。还使用了转基因斑马鱼模型测量肾脏的功能变化。在转基因斑马鱼中测量了绿色荧光蛋白 (GFP)，作为蛋白尿和维生素 D 结合蛋白 (VDBP) 的间接示踪剂，这是与哺乳动物白蛋白最接近的同源物。虽然转基因斑马鱼模型可能会在未来取代更多劳动密集型的传统方法但迄今为止只有少数研究采用了转基因模型。

形态和组织学变化：斑马鱼肾脏的一些形态学变化已被用作肾脏毒性的终点。包括肾小球、前肾小管和导管的形态学改变。 此外，据报道，在暴露于多种化学物质后会出现肾水肿或肾积液。具有特定组织荧光标记的转基因斑马鱼模型也已用于证明肾脏的形态变化。例如，斑马鱼Tg（wt1b:GFP）模型用绿色荧光标记肾小球、前肾小管和导管，并检查其形态变化。转基因斑马鱼，如 Tg(PT:EGFP)、Tg(wt1b: GFP) 和 NTR-mCherry 模型分别用于评估近端小管、前肾管和足细胞缺陷的结构变化。使用转基因斑马鱼模型可以直接观察肾脏的结构变化，即使在生命的早期阶段也是如此。与野生型斑马鱼相比，转基因斑马鱼模型有一些局限性，例如难以饲养到成年阶段，以及生命阶段之间的遗传或结构差异。许多研究测量了斑马鱼作为化学品肾毒性标志物的肾小球、肾小管或导管的特定组织病理学变化。组织学观察通常采用石蜡固定和染料染色或免疫组织化学方法。 已报道肾小球足细胞的囊肿形成和组织学变化。已评估了肾小管血液积聚、管腔扩张、溶酶体磷脂病和其他异常或杂乱形状的肾小管、囊肿和间充质细胞。

细胞和分子标记：在细胞水平上，细胞凋亡或坏死被用来证明化学暴露的肾毒性和相关机制。TUNEL 试验已用于显示肾小球或肾小管细胞的凋亡。Pax2a是一种在某些哺乳动物AKI模型中损伤后重新激活的转录因子，在暴露于这种肾毒性药物后，Pax2a被证明存在于斑马鱼仔鱼的近端小管中。Bax/Bcl2 比率的增加也用于指示斑马鱼的促细胞凋亡。通过激活聚ADP核糖聚合酶（PARP）或使用细胞死亡检测试剂盒检测肾细胞死亡。测量了几个分子终点以指示肾脏中的氧化应激。量化斑马鱼肾脏中的过氧化氢酶、谷胱甘肽-s-转移酶（GST）、谷胱甘肽还原酶（GR）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等抗氧化酶以及活性氧化物种（ROS）的增加以表明暴露于三氧化二砷和微囊藻毒素LR等化学物质后，肾脏发生氧化损伤。脂质过氧化的副产物，例如硫代巴巴多斯酸反应物质（TBARS），也可以用作氧化应激的生物标记物。斑马鱼幼体中嘌呤、谷胱甘肽和氨基酸（腺苷、肌酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、鸟苷、次黄嘌呤、酪氨酸、黄嘌呤）的代谢产物可能与暴露于某些药物引起的肾小管损伤有关。

其他细胞损伤的分子标记物已用于评估肾毒性。例如，顺铂诱导的DNA损伤标记物γH2AX增加。由于这些标记物中的许多并非仅在肾脏中特异表达，因此通常在分离的肾组织中测量这些标记物以支持肾毒性：示例包括在斑马鱼肾脏中定量组蛋白变体H2AX（γH2AX）的磷酸化Ser-139残基，这是一种DNA损伤标记。肾小管中的免疫染色定量α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），肌成纤维细胞标记物。细胞和分子标记都可用于填补转录和形态观察之间的空白，并可能提供机制理解和与不良肾脏结果相关的证据。

基因的转录变化：已经提出与肾毒性相关的基因的转录变化来筛选和阐明化学诱导的肾毒性的机制。经常使用与正常肾功能和肾发生相关的基因。 Nephrin 编码一种蛋白质 nephrin，它是肾小球滤过屏障的重要组成部分，用于破坏肾小球滤过屏障。与胚胎斑马鱼的肾脏发育相关的 wt1a 和 wt1b 被用来暗示肾脏发育异常：这些基因在暴露于化学物质（例如阿霉素）后发生转录变化。cadherin-17 (cdh17) 基因是肾脏发育的另一个标志物。在暴露于氯化镉和赭曲霉毒素 A 后，在斑马鱼仔鱼中观察到 cdh17 的下调。肾损伤分子-1（kim-1）是一种不仅在人类中而且在斑马鱼中编码kim蛋白的基因。KIM蛋白是一种上皮吞噬细胞受体，经常用于指示肾小管损伤。因此，kim-1 基因的上调可以解释为 AKI 的一个指征。注射庆大霉素后，斑马鱼幼体中kim-1基因表达上调。虽然已知kim-3和kim-4基因在斑马鱼中表达，但kim-1（kim1-s和kim1-l）通常是首选标记，因为该基因主要在肾脏而不是其他器官中表达。肾损伤标记基因的调控类型和模式因化学物质而异，这表明这些标记基因的调控变化模式可用于阐明或区分不同化学物质的肾毒性模式。因为成年斑马鱼肾脏的分离更容易所中更频繁地测量到基因转录的组织特异性改变。胚胎仔鱼肾脏的分离不容易完成，因此通常使用全身匀浆进行测量。其他终点与胚胎仔鱼观察一起测量，以支持肾毒性的可能性。

化学性肾毒性的主要机制：斑马鱼化学诱导肾毒性的主要机制包括但不限于细胞凋亡、细胞死亡、纤维化、炎症和氧化应激。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，是生物体维持的重要机制，但它可能导致急性和慢性毒性：过度的细胞凋亡可能导致细胞萎缩，并可能导致纤维化，最终导致肾功能障碍。因此，细胞凋亡被认为是肾损伤的重要机制之一。成年雌性斑马鱼在暴露于微囊藻毒素 60 天后肾脏样本发现典型的肾毒素凋亡相关基因的调节变化，例如 bcl-2、bax、bid、caspase-3、caspase-8 和 caspase-9 -LR。肾细胞死亡可能导致肾功能损害和肾损害。例如，接触中药马钱子后荧光显微镜观察到肾细胞死亡。接触顺铂的斑马鱼肾脏中也检测到细胞死亡标记物聚ADP核糖聚合酶（PARP）。使用 5-溴-2-脱氧尿苷 (BrdU) 标记来测量转基因斑马鱼 (Tg(podocin:NTR-GFP))肾损伤的恢复--足细胞的增殖情况。虽然最终可能导致斑马鱼死亡，但斑马鱼肾脏中的细胞死亡可以暂时恢复：这就是为什么在成年斑马鱼模型或长期暴露模型中无法轻易观察到细胞死亡的原因。 DNA损伤是细胞死亡的原因之一。在斑马鱼中，通过western blotting测定DNA损伤标记物γH2AX，以确定顺铂暴露的肾毒性。纤维化是导致肾损伤的主要机制。在啮齿动物中证明了马兜铃酸诱导肾纤维化。斑马鱼肾脏毒性机制的纤维化尚未得到很好的描述：马兜铃酸暴露既不影响肌成纤维细胞标志物 α-SMA，也不改变纤维化标志基因的转录，例如 col4a1、fn1a、acta2、tgfb1a、 肿瘤坏死因子基因。与上皮-间充质转化（EMT）相关的vim基因和与EMT诱导剂相关的mmp9基因的上调表明斑马鱼也可能发生肾纤维化。炎症是另一种与肾毒性有关的现象。炎症可能导致器官衰竭。炎症主要由先天免疫细胞介导是一种正常的生理过程，可以清除受损或坏死的细胞，在肾脏中观察到的炎症相关指标可用于提示化学暴露引起的急性肾损伤。促炎标志物，例如 cox1、cox2、cox2a、il-1β、il-6、tnfα 和 mpo 基因用于评估斑马鱼胚胎的炎症损伤。胚胎仔鱼炎症标记物通常整体测量，可能并不代表肾脏特异性损伤。可以相对容易地分离幼年或成年斑马鱼肾脏，因此，可以测量炎症标记物的肾脏特异性变化并将其用作阐明化学诱导肾毒性机制的一个有希望的工具。

氧化应激是另一种经常研究的机制，可以解释化学诱导的肾毒性。 据报道，许多化学品或药物会产生 ROS 并导致肾脏功能改变。暴露于肾毒物后，斑马鱼体内 ROS 和抗氧化酶活性增加。内质网 (ER) 应激可能是斑马鱼中一种重要的化学诱导毒性机制，尽管没有实验研究表明斑马鱼中的 ER 应激。ER负责蛋白质翻译后的蛋白质折叠和分选， ER应激可能导致蛋白质未折叠或折叠不当最终导致功能异常。热休克反应 (HSR) 与化学诱导的肾毒性有关。

图2、不同类型化学品引起肾毒性的主要机制。

结论：环境化学物质是肾病的重要危险因素。本文展示了斑马鱼作为化学诱导肾毒性的实验模型的效用。根据现有文献信息总结了已经或可以在斑马鱼中评估的主要观察终点和肾毒性模式。虽然斑马鱼模型存在一些局限性，例如，不同生命阶段不同的肾脏类型，可影响免疫功能、再生能力的肾骨髓和仔鱼肾脏分离困难，在研究化学暴露引起的肾毒性和损伤方面斑马鱼是一种很有前景的实验模型。胚胎-仔鱼斑马鱼可以为肾脏毒物化学物质提供高效快速的筛查措施。成年斑马鱼模型可用于测量肾脏特异性标记物，从而对化学诱导的肾毒性进行最终确认和机制评估。

原文出自：Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for screening nephrotoxic chemicals and related mechanisms - ScienceDirect