简介：纳米材料因其体积小、用途广泛等特点，在工业和医学领域得到广泛应用。然而，纳米材料也会对健康产生意想不到的不利影响。 神经系统暴露于纳米材料会导致严重的神经功能障碍和神经退行性疾病。许多研究采用各种动物模型来评估纳米材料的神经毒性作用。斑马鱼因其良好的神经系统特征、高效的基因组编辑、方便的转基因品系生成、高分辨率体内成像和一系列行为分析等优势，已成为神经毒性研究的一个有吸引力的动物模型。总结了最近使用斑马鱼对纳米材料，特别是工程纳米材料和纳米塑料的神经毒性效应的研究，并讨论了斑马鱼模型在神经毒性研究中的优势和局限性。

关键词：纳米材料  聚苯乙烯纳米材料  工程纳米材料  斑马鱼  动物模型  神经毒性

简介：纳米材料由有机、无机或有机金属材料组成的纳米尺寸材料，可分为天然、偶然和工程纳米材料 (ENM)。由于尺寸小，具有不同寻常的特性，可应用于各种领域，例如纳米生物技术或纳米医学。由于独特的性质对纳米材料安全性的担忧也在增加。纳米材料可以通过多种途径进入人体，例如消耗纳米产品或吸入偶然的纳米材料。体内的纳米材料可能穿过生物屏障穿透各种器官，并与固有的生物系统相互作用意味着它们会意外地造成不良影响。特别是暴露于人体的纳米材料可以从鼻子、肺、胃肠道或皮肤转移到通过血液和淋巴系统到达大脑，并可能导致神经功能障碍和神经退行性疾病。大量研究报告了纳米材料的神经毒性效应主要集中在ENM上。纳米塑料（NPs）是纳米毒性的另一类重要纳米材料，是由塑料废物通过风化作用偶然形成的。基于它们的定义、物理化学性质以及环境命运和行为，它们与 ENM 不同。除了细胞研究外，使用适当的动物模型进行毒性评估是必不可少的。已采用各种动物模型来证明纳米材料通过多种病因引起神经功能障碍和相关疾病，例如炎症、氧化应激、DNA 损伤和神经元死亡。ENMs的神经毒性主要通过啮齿动物模型（如小鼠或大鼠）进行评估，而NPs的神经毒性则通过鱼类模型进行评估。在动物模型中，小鼠是最受欢迎的神经毒性动物模型之一：它具有复杂行为分析的优势，与人类同源的器官和基因以及各种遗传工具和疾病模型具有高度相似性，但实验成本低，实验周期长 , 伦理问题是它作为动物模型的局限性。另一种用于神经毒性研究的新兴动物模型是斑马鱼，它在评估纳米材料对 ENM 和 NPs 的神经学影响方面具有若干优势，包括神经行为、神经发育和神经功能测定。尽管使用斑马鱼对纳米材料的神经毒性研究仍处于初级阶段但它们在不同的研究领域有许多潜在的应用。讨论了以斑马鱼为动物模型的人类纳米材料神经毒性的最新研究并提出了进一步神经毒性研究的方向。

纳米材料在动物模型中的神经毒性：由于形态、物理化学和生物学特性，ENMs 和 NPs 都可能对健康产生不利影响。暴露于神经系统的纳米材料可能会诱发神经元失调并最终导致相关的神经系统疾病，包括严重的神经退行性疾病，如阿尔茨海默病 (AD)、帕金森病 (PD) 和亨廷顿病。讨论了纳米材料的特性与其毒性之间的相关性，并总结了最近使用动物模型（不包括斑马鱼）对ENMs和NPs引起的神经功能障碍的研究。

ENMs的特性和毒性：ENM是人类有意设计或生产的纳米材料，包括金属和金属氧化物纳米颗粒。环境管理系统的多样性、复杂性和复杂性得到了显著改善，导致其应用于各个领域，包括食品工业、化妆品、体育、纺织和医药。ENM也可能与神经系统中的非目标生物实体相互作用最终导致认知障碍和神经退行性疾病，突出其独特的双刃特征。ENM的形态特征是指具有一个或多个维度的小于或等于100nm的纳米材料。形态特征（如大小和形状）可能影响ENM与生物系统的相互作用，包括内吞作用、生物分子吸收或器官分布。小鼠体内氧化铁磁性纳米粒子 (IOMNs) 的毒理学研究表明器官分布具有大小依赖性，较小尺寸的 IONMs 穿透更深并诱导与氧化应激和代谢过程相关的基因表达显著变化。基于银纳米粒子 (AgNPs) 的毒理学研究还表明，较小的尺寸会通过诱导氧化应激或金属离子释放来增加毒性。此外，ENM 的形状会影响它们的毒性，阻碍它们的清除。

ENM的物理化学特性（如组成、电荷、疏水性、表面官能团等）是决定其命运的关键因素，与毒性密切相关。金属基 ENM 的命运会受到各种因素的影响，例如 pH 值、温度、离子强度、溶解氧和天然有机物，所有这些都会影响它们的毒性。例如，金属离子可能通过酸性pH从金属基ENM（ZnO或Ag）中释放，可能对生物体造成毒性。AgNPs的毒理学研究表明氧水平或pH值会加速AgNPs表面银离子的释放，可能导致氧化应激或炎症反应。表面电荷和疏水性也会影响 ENMs 的毒性。 带正电荷或疏水的 ENM 比带负电荷的 ENM 或亲水 ENM 更容易被细胞内化并诱导氧化应激、自噬和细胞凋亡。ENMs 的这些形态和物理化学特性使它们能够与蛋白质、膜、磷脂、细胞器或 DNA 等生物成分积极相互作用从而诱导细胞内摄取、组织穿透、分布和器官积累对生物体产生不利影响。蛋白质电晕的形成可以改变与生物实体的相互作用及其毒理学效应。需要将ENM与不同生物成分的相互作用视为了解其毒理学效应的重要特征。

ENMs在动物模型中的体内神经毒性：已经在细胞系中研究了具有不同形态、物理化学特征和生物相互作用的 ENM 的神经毒性作用。二氧化硅纳米粒子 (SiO2-NPs) 影响神经元 PC12 细胞周期、细胞凋亡和多巴胺表达，氧化锌纳米粒子 (nano-ZnO) 破坏神经元 PC12细胞增殖。与使用神经元细胞系进行的大量关于ENM对特定神经元细胞损伤的关键研究相比，体内研究仍然有限。除啮齿动物模型（如小鼠和大鼠）外，包括蠕虫（秀丽隐杆线虫、秀丽隐杆虫）、苍蝇（果蝇、黑腹果蝇）或斑马鱼在内的几种动物模型已被最常用于神经毒性研究。啮齿动物作为最流行的神经毒理学模型，观察到各种神经学效应，包括 ENM 易位到神经系统、活性氧 (ROS) 生成、炎症和器官反应。AgNPs转移到小鼠模型的大脑会造成有害影响，如长期记忆障碍。暴露于 TiO2、ZnO 或 Al2O3 纳米颗粒的小鼠大脑表现出大脑皮层中多巴胺和去甲肾上腺素和氧化应激的增加。小鼠大脑中的 AgNP 治疗导致乙酰胆碱酯酶、多巴胺和血清素的消耗。Fe3O4 纳米颗粒在大鼠脑的纹状体和海马中积累，并导致神经元活力和氧化应激降低。TiO2纳米颗粒（TiO2 NP）诱导的氧化应激由p38-Nrf2信号通路介导，伴随着炎性细胞浸润到小鼠大脑和破裂的神经细胞中。啮齿动物模型允许分析ENM暴露的各种影响，例如神经毒性的分子机制和神经递质变化。啮齿动物模型还可以根据器官反应评估代际影响的风险。小鼠妊娠和哺乳期暴露的TiO2 NP会诱导小鼠后代海马的凋亡和神经发生减少，损害记忆和学习，以及后代小鼠的大脑发育和认知障碍。

非啮齿动物模型，如黑腹果蝇、秀丽隐杆线虫或斑马鱼，正在成为传统啮齿动物模型的有价值替代品，允许利用多种分子和遗传工具。黑腹果蝇具有多种优势，例如易于区分的表型阵列、易于进行基因操作与人类致病基因的相似性高于 70%以及伦理问题少等优势。暴露于 AgNPs 和 ZnO 纳米颗粒可诱导黑腹果蝇神经毒性，例如神经母细胞畸形和神经肌肉协调。黑腹果蝇的多种神经退行性疾病模型可用于研究神经系统影响，例如运动障碍和神经毒性反应，用于神经毒性研究。秀丽隐杆线虫包含几乎所有涉及哺乳动物神经递质的基因家族，神经元损伤和神经元动力学再生可以用荧光标记物可视化。长期暴露于 Al2O3 纳米颗粒 (Al2O3-NPs) 可导致秀丽隐杆线虫运动行为、应激反应和氧化应激下降。Al2O3-NPs 通过影响秀丽隐杆线虫的谷氨酸能、5-羟色胺能和多巴胺能系统来影响运动行为。

NPs 在体内动物模型中的神经毒性：尽管提出了纳米塑料的风险，但已对有限类型的塑料（包括PS）进行了测试，只有少数研究报告了使用啮齿动物模型的NP诱导的神经效应，这与许多ENM神经毒性研究不同。主要使用细胞系或非啮齿动物模型进行研究NPs的神经毒性。暴露于聚苯乙烯纳米塑料（PSNP）的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞显示出突起生长收缩、细胞核形态改变和肿胀以及细胞内成分溢出。PSNP通过小泡介导的内吞作用被SH-SY5Y细胞内化，并可诱导错误的细胞凋亡。对秀丽隐杆线虫中NPs 的神经毒理学研究表明，PSNPs 诱导 ROS 产生和线粒体损伤从而抑制体长、身体弯曲和多巴胺含量。主要利用海洋生物来评估NPs的神经毒性。 几项鱼模型研究表明PSNPs 在大脑中积累并诱导不利的神经系统影响，例如大脑体重减轻、乙酰胆碱酯酶 (AChE) 抑制和行为变化，表明 NPs 也可以诱导神经系统功能障碍。在各种动物模型中，斑马鱼模型是评估 NPs 神经效应的流行模型之一。 下面将进一步讨论使用斑马鱼作为 NPs 神经毒理学研究的动物模型的特征、优势、局限性和未来方向。

图 1 具有不同形态和特征的ENMs和NP代表的纳米材料的物理化学特征以及用于验证其神经毒性的各种动物模型。

斑马鱼作为神经毒性研究体内动物模型的优势：从遗传学和发育生物学的基础研究到人类疾病的治疗应用和药物发现，斑马鱼已被广泛用作基本的动物模型。斑马鱼作为验证新制造的化学品和纳米材料毒性的强大模型系统引起了广泛关注。

斑马鱼神经系统和神经化学：斑马鱼大脑的神经元组成、神经化学和代谢在人类和哺乳动物中高度保守。斑马鱼大脑发育过程中神经管在受精后12小时（hpf）开始形成，16 hpf可清晰区分前脑（端脑和间脑）、中脑（中脑）和后脑（菱形脑）。斑马鱼的大脑区域与人类大脑的新皮质、海马和杏仁核类似，位于前脑皮层，主要负责认知、记忆功能以及恐惧和焦虑等情绪。下丘脑、缰核和松果体主要参与控制每一种感觉冲动、生殖行为和昼夜节律。

图2.说明斑马鱼BBB、仔鱼和成年脑的结构以及PSNP的神经毒性作用示意图。

大脑通过神经递质传递信号来处理各种生物活动所必需的信息，这些神经递质充当每个神经元分泌的兴奋剂、抑制剂和神经调节剂。兴奋性神经递质包括谷氨酸和乙酰胆碱，抑制性神经递素包括甘氨酸和γ-氨基丁酸（GABA），单胺类神经递质家族包括5-羟色胺、组胺和儿茶酚胺，包括多巴胺、肾上腺素（肾上腺素）和去甲肾上腺素。发育中的斑马鱼大脑中 GABA 能、谷氨酸能、5-羟色胺能和儿茶酚胺能神经元的分化非常迅速，几乎在受精后 2-3 天 (dpf) 完成。斑马鱼在整个大脑中与哺乳动物和人类共享高度保守的神经递质和神经元细胞，具有一定的区域特异性。

斑马鱼血脑屏障：血脑屏障（BBB）以高选择性调节大脑和附近血管之间的联系，由多种细胞类型组成，包括内皮细胞、星形胶质细胞末端足细胞和具有紧密连接的周细胞。斑马鱼的BBB在2.5至3 dpf之间开始形成，尽管在24–72 hpf之间的脑血管周围和60 hpf后的周细胞周围检测到紧密连接的成分。将不同大小的荧光染料注入斑马鱼幼体的心包区域证明BBB的成熟是从3dpf到10dpf以时间依赖性的方式逐渐实现的。尽管斑马鱼BBB成熟完成的确切发育窗口尚未完全确定，但BBB功能在其他脊椎动物（包括小鼠）中保存良好。纳米材料由于其纳米尺寸、非典型形状和其周围具有各种特性的效应器而具有穿透血脑屏障的潜力。但目前尚不清楚ENM和NP是否通过结合特定受体的BBB或简单地通过破坏组织而系统性地到达大脑。

评估纳米材料对个体神经毒性的遗传贡献：为了研究特定环境下特定基因的功能、脆弱性和生物学机制，多年来斑马鱼基因敲除和敲入的基因组编辑技术不断发展。CRISPR/Cas 系统已广泛用于斑马鱼，将靶基因特异性单向导 RNA 和 Cas9 核酸内切酶的复合物注射到受精胚胎中，通过非同源末端连接或同源定向修复诱导感兴趣基因的突变。

体内成像：生物监测染料和荧光转基因系

斑马鱼的一项突出技术是利用生物监测染料或转基因系染色进行体内成像。通过PTU（1-苯基-2-硫脲）处理或色素沉着突变体（如casper），可以在无色素沉着斑马鱼体内观察动物深层组织中的细胞事件。抗体免疫染色、末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记 (TUNEL) 染色、氧化应激测量和原位杂交的成熟成像方案都适用于使用斑马鱼研究纳米材料的神经毒性。尽管纳米材料被证明能到达大脑，诱导神经细胞凋亡，破坏大脑发育/成熟，并在一些模型生物体中改变神经递质。荧光转基因斑马鱼系在纳米材料的神经毒性研究领域尚未得到充分利用。这些品系可以成为一种强大的工具，以组织特异性的方式可视化分子或细胞的体内动力学并了解大脑功能，从而有助于在体内详细研究纳米材料在神经毒性中的多种效应。荧光标记的斑马鱼大脑可以通过采用显微镜技术包括共焦、光片和多光子显微镜，结合组织清除技术，在体内以单细胞分辨率成像。

斑马鱼 ENMs 和 NPs 的神经毒性研究：

TiO2-NPs 的神经毒性：为了验证TiO2 NP诱导的神经毒性，用平均直径为12nm的TiO2 NPs处理斑马鱼幼鱼，在明暗交替刺激下表现出游泳速度和转向行为能力降低。神经发生的 Nrd 和 Elavl3 和轴突生长的 alpha1-tubulin、mbp 和 gap43 的基因表达发生了显著变化，而氧化应激的 Mn-sod、Cu/Zn-sod 和 Cat 基因没有改变。Y-迷宫测试中臂访问次数减少，TiO2 NP处理后证实c-fos、c-jun和bdnf基因表达增加，p38、NGF、CREB、NR1、NR2ab和GluR2表达减少。斑马鱼幼体模型还发现TiO2 NP处理后，帕金森病患者的运动行为活性降低、多巴胺能神经元丢失和与路易体形成相关的基因表达改变表明TiO2 NPP暴露在帕金森病的发病风险因素中起作用。

SiO2-NPs 的神经毒性：SiO2-NP 处理促进了抑郁表型，基于运动和探索行为参数，并改变了斑马鱼模型中免疫组织化学证实的酪氨酸羟化酶和血清素的表达。根据斑马鱼的发育阶段以及SiO2 NP的大小、浓度和不同暴露时间，进行了PMR和VMR的神经毒性行为测试，一致显示了用SiO2 NPs处理后斑马鱼胚胎和仔鱼的行为反应变化。注射 SiO2-NP 的斑马鱼胚胎的微阵列分析表明与多巴胺、GABA、胆碱和神经肽受体的神经功能相关的基因表达显着下调。发现 SiO2-NPs 暴露会改变帕金森病相关基因如 β-突触核蛋白和 pink1 的表达。尽管上述神经毒性数据验证了TiO2 NP和SiO2 NP的ENM影响了行为反应和与神经元功能相关的基因表达模式，但使用斑马鱼对具有不同物理化学性质的不同ENM进行神经毒性研究仍不足以揭示其确切作用和详细的潜在机制。

PSNPs 在斑马鱼中的神经毒性：由于其非典型特征和小尺寸，PSNP可以通过BBB穿透包括大脑在内的器官，在细胞内细胞器中积累，与一系列蛋白质相互作用，并最终影响各种生物功能。几项研究报告称，PSNP在几天内很容易在斑马鱼的大脑和其他器官中积累，并显著影响该器官的功能。用于斑马鱼神经毒性分析的PSNP主要是直径约为20-100nm的荧光聚苯乙烯颗粒，浓度范围为0.1-100ppm。斑马鱼仔鱼交替光刺激诱导的 VMR 反应已被用于多项研究来确定 PSNP 的行为神经毒性作用。 结果，主要通过 VMR 测试观察到一些组活动减退，而另一组则相反多动症。这种差异可能是由于实验条件的差异造成的，例如PSNP的大小、浓度、暴露时间和斑马鱼的发育阶段，因此需要进行更多的对照研究以了解PSNP确切的行为模式和影响。PSNP 处理的成年斑马鱼的各种行为包括社交互动、平均速度、探索行为、攻击和捕食者回避、浅滩行为和昼夜节律都发生了改变表明PSNP会诱发行为神经毒性，尽管仍需要更多的研究来揭示PSNP与动物行为之间的联系。由活性氧代谢中断引起的氧化应激会对行为改变和发育过程产生不利影响，是PSNP诱发的主要事件之一。用氧化应激标记物8-OHdG抗体对斑马鱼胚胎脑组织的神经元细胞进行PSNP聚集区染色。暴露于 PSNP 后成年大脑中谷胱甘肽还原酶的活性降低，其在后代仔鱼中的活性也比亲代暴露组降低表明谷胱甘肽代谢是PSNP跨代的主要目标之一。PSNP诱导了除了仔鱼和成虫大脑外，包括胃肠道、肝脏和心脏各种组织的氧化应激。乙酰胆碱酯酶是一种催化乙酰胆碱水解来终止信号传递的酶，在最近的神经毒性研究中被提议作为生物标志物。即使在较低浓度下PSNP处理后，幼鱼和成年斑马鱼大脑中的乙酰胆碱酯酶也有所降低。在特定情况下，某些基因突变可能会增加其神经毒性的脆弱性。转基因斑马鱼允许识别和验证体内更易受PSNP影响的基因突变。PSNP处理的野生型斑马鱼仔鱼表现出活跃过度和应激激素皮质醇水平升高。

结论和展望：我们讨论了 ENMs 和 PSNPs 作为代表性纳米材料的一般特征，并回顾了对最近使用动物模型（特别是斑马鱼）的神经毒性。尽管进行了深入研究但对纳米材料神经毒性的功能验证和对其机制的理解仍然模糊不清。大量不断合成和修饰的纳米材料使得分析其神经毒性作用变得更加困难。斑马鱼作为一种合适的动物模型允许利用方便和有效的实验方法包括转基因系、敲除/敲入和一系列既定的行为测试，以及高分辨率成像来分析多种类型纳米材料的神经毒性。斑马鱼将为体内纳米毒性研究提供巨大的机会有助于理解神经毒性作用机制及开发更好更安全的纳米材料。

原文出自：A review on the impacts of nanomaterials on neuromodulation and neurological dysfunction using a zebrafish animal model - ScienceDirect