摘要：动物在很大程度上依赖其神经和免疫系统感知环境并在环境中生存。尽管传统观点认为大脑是免疫特权器官，但神经和免疫系统相互作用会产生重大后果。环境中的微生物是刺激的主要来源，可以与动物宿主建立从致病性到互惠性的关系。各种人类和实验动物系统的研究表明微生物群与神经和免疫系统之间的相互作用对正常发育、体内平衡和疾病有重要贡献。由于易于遗传和微生物操作以及光学透明性便于体内成像，斑马鱼已经成为探索这些相互作用的优秀模型。本文总结了利用斑马鱼分析免疫和神经系统、神经系统和微生物群以及微生物群和免疫系统之间的双向控制的研究。本文帮助我们理解这些系统在鱼类感染过程中的相互联系以及干扰如何导致病理。

背景：越来越多的人认识到脊椎动物中存在免疫系统、神经系统和微生物群之间的深层相互联系，对每个系统的发育和稳态以及整个生物体的健康都很重要。例如，在大脑中免疫系统和神经系统之间建立了正常的神经连接，在外围储备了免疫细胞，而肠道神经系统在塑造肠道微生物生态方面起着重要作用，而肠道微生物生态反过来又会影响行为模式。免疫系统本身对于控制微生物群组成非常重要而微生物群组成是肠道病原体易感性的主要决定因素。这些系统相互作用以促进正常发育和体内平衡。当面临感染或损伤等外部威胁时，系统之间的协调对稳态恢复非常重要。系统之间失调会导致病理。斑马鱼作为一种模式生物，能够深入了解免疫系统、神经系统和微生物群之间的相互作用。斑马鱼胚胎和仔鱼的光学透明性加上转基因鱼系的发展壮大，感兴趣的细胞被荧光标记，，有助于在发育过程中以及在感染或损伤时实时观察完整活脊椎动物的免疫、神经和微生物群的相互作用。斑马鱼的免疫系统与哺乳动物非常相似，包括适应性和先天免疫细胞（B 细胞、T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等）和可溶性免疫介质，如细胞因子和补体蛋白。斑马鱼和哺乳动物的大脑结构、细胞和遗传程序之间也存在着强烈的同源性。斑马鱼是探索神经系统、免疫系统和微生物群之间相互作用深度和复杂性的有力模型，这些相互作用对维持活脊椎动物的组织健康非常重要。我们回顾了斑马鱼免疫系统和神经系统、神经系统和微生物群之间以及发育过程中促进这些系统间稳态的微生物群和免疫系统双向控制的现有文献。我们探讨了这些系统在鱼类感染期间的相互联系，以及干扰如何导致病理。

免疫系统、神经系统和微生物群之间的稳态控制：

神经系统的免疫控制：脊椎动物中，有明确的证据表明从细胞水平到行为水平的正常神经系统发育的免疫控制。人们早就认识到在细胞水平上神经元凋亡是促进发育中大脑正常神经连接的关键机制。这一过程早在斑马鱼受精后48小时（hpf）就发生。当观察到死亡和死亡的神经元时，小胶质细胞前体（注定要分化为中枢神经系统（CNS）中的常驻巨噬细胞）开始转运到大脑以清除凋亡小体。虽然脑中凋亡小体的小胶质细胞清除是神经系统发育的稳态免疫控制的一个明显例子，但这种控制是双向的。最近的研究表明正是神经元凋亡本身部分通过核苷酸信号将小胶质细胞前体招募到脑中，导致整个大脑中小胶质细胞的正常扩张和分布。

斑马鱼模型阐明神经系统、免疫系统和微生物群之间的稳态相互作用示例

有一些证据表明在行为水平上免疫控制社会行为，缺乏淋巴细胞的小鼠有社会缺陷，并在额叶皮层大脑区域表现出超连接性。这些缺陷被证明是由于脑膜T细胞缺乏IFN-γ释放所致，野生型动物的脑膜T淋巴细胞有助于大脑中的强直GABA能信号传导。虽然这项研究主要在小鼠中开展，但作者表明除了啮齿动物，斑马鱼和果蝇在社会环境中上调 IFN-γ 和 JAK-STAT 诱导基因。这项研究表明，IFN-γ信号传导和启动强大病原体防御的能力在动物群体中是共同进化的，病原体传播的可能性更大。虽然正常神经连接肯定存在免疫控制，但免疫系统在损伤后的组织再生中也起着关键作用。与哺乳动物不同，斑马鱼可以再生神经细胞，因此是了解神经再生如何发生的有价值的模型。希望将这些知识转化为未来的治疗方法以治疗创伤性脑和脊髓损伤以及神经退行性疾病。成年斑马鱼脑损伤后，白细胞募集到损伤部位，在损伤部位表达促炎性细胞因子（TNFα、IL1β和IL-8），炎症本身促进神经原细胞的增殖。当成年鱼形成适应性免疫时脊髓再生需要调节性T细胞（Treg）。Tregs 位于组织损伤部位，例如受损的脊髓组织，并释放对受损器官特异的再生因子，它是再生因子而不是 Tregs 表达的抗炎细胞因子，促进神经祖细胞的增殖。在阿尔茨海默病模型神经再生免疫控制的例子中，小胶质细胞产生的IL-4足以通过IL-4R/STAT6途径诱导成年斑马鱼大脑中因淀粉样β42毒性而发生神经变性的区域的神经原细胞增殖。

免疫系统的神经控制：

下丘脑-垂体-肾上腺轴对免疫细胞数量的控制：与上述发育中的大脑中小胶质细胞前体的凋亡神经元募集类似，免疫系统神经控制的另一个例子是中枢神经系统对周围造血干细胞 (HSC) 数量的调节。已证明在斑马鱼胚胎发育过程中缺氧等压力源可刺激 CNS 中血清素的产生。 5-羟色胺能刺激下丘脑-垂体-肾上腺/肾间 (HPA/I) 应激反应轴通过糖皮质激素受体增加外周 HSC 数量，最终增加可用免疫细胞的数量。同哺乳动物一样，地塞米松治疗斑马鱼仔鱼出现消耗胸腺细胞的短期效果。

昼夜节律和免疫：小鼠 HSC 的释放也每天受到昼夜节律振荡的调节，在光照和黑暗开始时每天两个 HSC 峰值。虽然尚不清楚昼夜节律是否调节斑马鱼 HSC 的释放，但昼夜节律确实对斑马鱼的免疫反应有很大影响，可以被认为是免疫系统神经控制的另一个例子。哺乳动物下丘脑视交叉上核（SCN）和HPA轴之间的神经内分泌相互作用同步了外周组织免疫反应的昼夜节律控制。昼夜节律是内源性振荡，可将生物体的生理过程调整为 ~ 24小时明暗循环。这些振荡对广泛的行为活动和细胞和器官系统功能施加时间控制，包括免疫功能，例如先天免疫细胞从骨髓到血液和免疫器官的日常排出、中性粒细胞运输、定位和周转、巨噬细胞吞噬活动 和细胞因子释放。在细胞水平上，昼夜节律振荡由一组保守的转录因子维持，这些转录因子执行一个互锁的、有节奏的、自我延续的转录-翻译反馈循环。 这些转录因子构成分子时钟机制，在身体的所有主要器官和组织中表达，并直接或间接地控制上述一系列过程。哺乳动物外围时钟通过位于下丘脑视交叉上核 (SCN) 中的主时钟或中央时钟与环境光暗循环同步。SCN 和 HPA 轴之间的神经内分泌相互作用最终使整个生物体组织中的外周时钟同步。 然而，这种层次结构并非对所有脊椎动物都通用， 斑马鱼没有 SCN 结构，这就引发了一个问题：鱼是否需要“主时钟”。最近的研究表明鱼可以通过“多起搏器系统”使用多个时钟中心来协调整个生物体的昼夜节律振荡，类似于鸟类。这些时钟中心中至少有一个位于松果体，内在的昼夜节律振荡直接被光通过具有视网膜视锥光感受器特征的细胞携带，然后驱动褪黑激素的产生。虽然与哺乳动物相比，鱼类的昼夜节律振荡的协调更加分散，但这并不意味着神经内分泌相互作用对于调节鱼类组织之间的这些振荡以及对免疫反应的昼夜节律控制不重要，相反是一个悬而未决的问题 。明暗循环确实对斑马鱼免疫有很大影响与哺乳动物类似。虽然目前尚不清楚这种免疫反应的光依赖性调节是否依赖于分子钟机制，或者光调节的神经内分泌相互作用是否对鱼类的免疫反应施加昼夜节律控制，但有一些证据表明，昼夜节律的双向免疫和神经系统控制。

微生物群控制神经系统：根据“肠-脑轴”范式，扰乱微生物群可能会导致行为改变甚至导致神经系统疾。这一概念已广受欢迎并引发了人们对饮食和/或益生菌可能有助于遏制神经退行性疾病发病率的上升的希望。斑马鱼至少在早期发育阶段是测试这些问题的一个强大系统，因为产生无菌仔鱼很容易且成本低，可以以可控的方式繁殖。用无菌的食物喂养这些无菌仔鱼以便在幼年阶段生长数周或在成年阶段生长数月。大多数的斑马鱼行为分析都是在仔鱼阶段进行的。仔鱼的初始行为包括狩猎、睡眠、学习，可以通过高通量测定在受精后6天（dpf）开展。在第二周发展社交互动（浅水行为）。益生菌乳酸杆菌的施用会引起浅水行为的细微变化，并且益生菌处理过的鱼更喜欢呆在水体中的较高位置。这与微生物群组成的微小但显著的变化有关，更引人注目的是与啮齿动物脑内bdnf表达的增加有关。BDNF（脑源性神经营养因子）是一种与各种情绪障碍有关的生长因子。一项对无菌仔鱼行为的早期研究发现与常规饲养或无菌常规化仔鱼相比，6 dpf 时自发运动增加。细菌也可能对肠道神经系统产生影响。 在单定殖或双定殖斑马鱼模型中细菌病原体（霍乱弧菌）被证明不仅可以通过直接的细菌相互作用还可通过影响肠道蠕动来取代无害的共生物种。实时成像是研究斑马鱼宿主-病原体相互作用的主要工具，但它通常需要通过麻醉和嵌入低熔点琼脂糖等凝胶来固定透明的仔鱼。常见的麻醉剂（例如三卡因甲磺酸盐）通常不会阻止蠕动运动，这使得肠道的实时成像极具挑战性。 以前曾报道过仅限于短时间的斑马鱼肠腔中细菌的直接成像。每 20 分钟对整个仔鱼进行快速成像，持续时间超过 12 小时。受霍乱弧菌感染的鱼类肠道收缩并不更频繁但要强烈得多导致气单胞菌排出。这取决于弧菌的 VI 型分泌系统 (T6SS)，弧菌直接杀死气单胞菌也是如此。微生物群定植于肠道以外的其他粘膜。精细显微解剖实验显示早在6dpf常规和GF仔鱼的嗅觉上皮出现转录差异。斑马鱼仔鱼和成年小鼠无菌状态导致许多嗅觉受体基因表达降低。这与嗅觉感觉上皮的细微形态学差异有关提示转录因子NRSF/REST在嗅觉器官微生物群依赖性基因抑制中起作用。

微生物群控制免疫系统：动物免疫系统已经进化到能够感知各种微生物刺激并将这些信息传递给免疫系统的组成部分。由于共生微生物群在动物进化历史中一直是刺激和潜在感染的源泉，作为其正常生命周期的一部分斑马鱼和其他动物的免疫系统确实会对微生物群作出反应。通过比较无菌饲养的斑马鱼和常规斑马鱼的微生物群，初步了解了斑马鱼对微生物群的免疫反应。这项工作表明微生物群定植刺激补体和急性期蛋白的表达以及上皮屏障功能。无菌斑马鱼试验分析表明微生物群刺激中性粒细胞标志物的表达、中性粒细胞向肠道募集、向外周伤口募集和其他全身性行为。预计对其他免疫细胞系也有类似的影响但仍有待研究。宿主对微生物群的免疫反应代表了对来自这些微生物群落的复杂刺激的聚合反应。无菌斑马鱼的研究表明宿主免疫反应能够对微生物群的个体成员或其产物产生显著的特异性。几项研究强调了宿主如何将复杂的微生物群落输入整合到适当的免疫反应中，这仍是一个重要的研究前沿。无菌斑马鱼定殖已知的共生细菌的混合物揭示特定菌株对中性粒细胞向肠道募集的影响不一定与该菌株在群落中的丰度成正比。确定共生微生物群调节宿主先天免疫的特定机制是另一个重要的研究领域。一个主要主题是微生物群影响宿主对炎症刺激的敏感性的能力。例如，微生物群定植导致肠道上皮中肠道碱性磷酸酶的宿主表达增加，这反过来又使肠道内的细菌脂多糖解毒，从而防止中性粒细胞过度募集到肠道。另一个新兴主题是微生物群调节宿主组织特异性免疫调节细胞因子产生的能力。例如，斑马鱼和哺乳动物的肠道和肝脏中的微生物群定殖时诱导急性期蛋白血清淀粉样蛋白A（Saa）。斑马鱼的遗传学研究表明其单一的Saa同源物可作为中性粒细胞的系统信号以限制激活，降低炎症张力和杀菌活性，同时增强其迁移至周围损伤部位的能力。结果强调肠道微生物定植可以影响肠道和肠外免疫的不同方面。已知微生物群的存在和组成是斑马鱼和其他动物对肠道病原体易感性的主要决定因素。

免疫系统控制微生物群：斑马鱼拥有 B 和 T 淋巴细胞的适应性免疫系统，携带涉及 RAG 蛋白的半随机重组机制产生的抗原受体。 事实上，rag1 缺陷斑马鱼缺乏 T 和 B 淋巴细胞已成为研究斑马鱼免疫系统的主要工具。斑马鱼适应性免疫功能在微生物群最初定植肠道后几周形成。已经发现 在 1 周龄时无法区分rag1 缺陷型斑马鱼和野生型斑马鱼的微生物群组成，但 5 周龄可明显区分。与1周龄仔鱼或rag1突变体相比，鱼类和哺乳动物主要病原体弧菌的丰度受到rag1依赖机制的强烈控制，野生型成虫的数量减少了4-5 log。将lck:GFP + 细胞（主要是 T 淋巴细胞）转移到 rag1 缺陷的鱼导致肠道中弧菌丰度的快速下降。表明这些鱼类中存在大量肠道弧菌特异性T细胞，，该细胞下调了潜在致病菌的数量。其他研究小组报告了成年野生型斑马鱼微生物群中的弧菌数量较多，这突出了其他因素（如饮食和水特性）在最终微生物群组成中的贡献。虽然饲养条件对最终微生物群组成有显著影响，但rag1基因型没有。与rag1突变体相比，野生型鱼类的个体差异更大表明适应性免疫系统确实塑造了微生物群的组成，但其可预测性较差。虽然在rag1突变体中研究了适应性免疫对微生物群组成的贡献，但先天免疫系统的影响尚未得到系统研究。这主要是由于与适应性免疫的综合特性相比，先天免疫系统具有非常模块化的特性，具有许多相对独立的组成部分；不可能通过单一突变使整个先天免疫系统失活。Myd88是TLR（toll样受体）和IL-1家族受体信号转导的主要适配器，MYD 88缺陷动物通常被视为先天免疫应答严重受损。Myd88突变斑马鱼确实存在严重的免疫缺陷，在3周龄（即适应性免疫开始前不久）将其与野生型鱼类进行了微生物群比较。在先天免疫细胞类型中，已证明 irf8 突变斑马鱼中缺乏的肠道巨噬细胞的主要亚群对微生物群组成有影响。

神经系统控制微生物群：与免疫系统一样，神经系统在感知外部环境和动物体内的特定刺激以及产生适当的直接和紧急反应方面发挥着主要作用。神经系统的基础活动和诱发反应对每个器官系统以及行为等突发现象都有影响。可以预期神经系统功能的不同方面直接或间接影响微生物群的组成和活性。神经系统控制微生物群的最佳证据来自对调节肠道运动和蠕动的肠神经系统（ENS）的分析。发现由于 sox10 转录因子突变而缺乏 ENS 的斑马鱼仔鱼肠道炎症升高。与sox10突变体中肠道微生物群组成的改变有关包括促炎弧菌的相对富集。与 WT 微生物群的 GF 受体相比，将 sox10 突变体的微生物群移植到 WT GF 受体导致肠道炎症增加，表明 ENS 通常起到限制微生物群促炎潜力的作用。使用一个GF 斑马鱼模型扩展了这一发现，其被促炎弧菌物种和/或共生气单胞菌物种组成的微生物群落定殖。发现这与弧菌诱导肠道运动的能力有关，该能力选择性地减少了气单胞菌的数量，而对弧菌没有类似的影响。

肠道内的病原体感应：导致神经病理学的细菌感染：感染引发的神经-免疫相互作用导致病理的最著名的例子之一是麻风分枝杆菌感染后的周围神经病变。先前的体外研究表明，周围神经损伤是麻风杆菌脱髓鞘和通过需要麻风杆菌外膜脂、酚糖脂 1 (PGL-1) 的相互作用感染雪旺氏细胞的直接结果。最近使用斑马鱼胚胎作为麻风杆菌感染的模型宿主的研究改变了这一观点。利用斑马鱼胚胎的光学透明性，研究作者直接观察了麻风杆菌感染后细菌、神经胶质细胞、神经细胞和免疫细胞的相互作用，并表明，虽然注入脊髓背侧的细菌能够改变轴突周围神经胶质细胞的髓鞘结构，但未观察到细菌本身直接感染神经胶质细胞。所有细菌都局限于巨噬细胞，这些巨噬细胞本身直接与神经细胞轴突相互作用并巡逻。M. leprae PGL-1 刺激巨噬细胞产生活性氮物质，这与随后有髓和无髓轴突的线粒体和轴突损伤有关。这项工作改变了对麻风杆菌感染后周围神经病变的早期事件的理解。考虑到麻风杆菌本身缺乏遗传工具，因为它是一种专性的细胞内病原体，并且缺乏可用于模拟麻风杆菌感染的遗传易处理宿主，利用斑马鱼胚胎来模拟这些相互作用是一项重要进展。虽然麻风杆菌感染与周围神经系统损伤有关，但少数其他细菌能够侵入中枢神经系统，导致脑膜炎，包括无乳链球菌和肺炎链球菌等链球菌。

涉及CNS侵袭的病理相互作用示例

病毒感染导致病理：通过直接影响神经元或通过神经炎症的间接影响，病原体感染中枢神经系统会导致行为改变。我们将重点关注斑马鱼中枢神经系统的病毒感染及其影响。我们对斑马鱼病毒感染的大部分知识来源于实验性感染系统，感染系统中有来自其他鱼类的病毒，有时也有来自人类的病毒，因为很长一段时间没有发现天然斑马鱼病毒。ZfPV已在实验室斑马鱼中检测到，并在世界各地的设施中广泛存在。尚未报告 CG2 斑马鱼中 zfPV 感染的病理或行为数据。NNV（神经坏死病毒）是多种热带和温带养殖海洋鱼类中病毒性神经坏死或病毒性脑病和视网膜病的病原体。已经建立了 NNV 感染的斑马鱼模型，并且发现病毒嗜性（包括大脑中的最高数量）与在自然宿主中观察到的相似。仔鱼的死亡非常快，与较高的病毒滴度和较弱的I型干扰素应答有关。 

结论：本文回顾的文献强调了斑马鱼作为研究神经系统、免疫系统、共生微生物和致病微生物之间复杂和相互作用的模型的广泛用途。大多数这些见解都是由斑马鱼系统的提供的。该领域的未来扩展将继续需要更多的工具来成像和操纵特定的神经和免疫细胞类型和亚型以及它们的信号和其他活动。在宿主和微生物以及斑马鱼系统中的化学和毒理学筛选中增加遗传筛选的应用，将在更广泛领域增加这一非哺乳动物系统的价值。尽管这些斑马鱼研究提供了对神经-免疫-微生物相互作用的深入了解，但这些现有研究中的大多数都集中在成对的神经-免疫、免疫-微生物、微生物-神经相互作用上。考虑到所涉及的额外复杂性也许并不奇怪，相对较少的研究将所有三个组成部分一起考虑。未来的研究需要同时考虑免疫和神经系统以及微生物相互作用，以便更快地推进该领域。此类研究将为已知涉及这三种成分的复杂疾病的机制提供强有力的见解。上述发现绝大多数处于相对早期的胚胎和仔鱼阶段。斑马鱼模型将继续作为该领域未来研究中有价值的非哺乳动物模型系统。

原文出自：Using zebrafish to understand reciprocal interactions between the nervous and immune systems and the microbial world | SpringerLink