一、前言

CAR-T细胞疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell immunotherapy）即：嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是指通过向T细胞中导入一种人工设计的CAR分子，赋予T细胞靶向功能，再将这种改造后的CAR-T细胞回输到患者体内进行治疗。CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞机制不具有MHC限制性，通过结合靶向抗原即可被活化，从而高效杀伤肿瘤细胞。CAR是一种的人工改造的受体分子，它可以赋予免疫细胞被某个特定靶点激活的特异性，从而增强细胞识别抗原信号与活化的功能。 

因此，CAR分子的设计是CAR-T细胞疗法的关键环节。尽管CAR-T细胞疗法在血液瘤中取得了空前成功，但依旧面临一些挑战，例如在CAR分子设计和细胞功能的改进等方面仍有很大的空间。 

二、CAR分子的基本结构

CAR分子包括三个主要部分：胞外域、跨膜域和胞内域（图1）。胞外域中的抗原结合域通常是一个抗体来源的单链片段scFv分子，主要由抗体的可变轻链（V_L）和可变重链（V_H）及中间的Linker区连接组成，再通过铰链区（Hinge）连接到跨膜结构域，负责识别抗原。跨膜域的主要功能在于将CAR分子锚定在细胞膜上，其对CAR分子表达的稳定性具有重要作用。胞内域则包括共刺激结构域和信号转导结构域，二者合力负责T细胞的完全活化。 

图1 CAR分子结构示意图

以下将对CAR分子的各个部分逐一介绍。 

scFv靶向肿瘤抗原的特异性及亲和力是CAR-T疗法安全有效性的基础。肿瘤相关抗原（TAA）是免疫治疗的主要靶点，在肿瘤组织中高度表达，在健康组织中也有较低水平表达。这会形成对非肿瘤组织的脱靶损伤（On-target, Off-tumor），有时还会产生危及生命的毒性。因此，用于CAR分子设计的scFv的特异性至关重要。为了避免On-target, off-tumor副作用，抗体的特异性研究是十分重要的。 

scFv的亲和力特征是一个特别重要的抗原结合结构域参数，它解释了多种受体－配体相互作用，从根本上决定了CAR分子的功能。为了识别肿瘤细胞上的抗原，诱导CAR信号传导并激活T细胞，CAR分子的抗原结合亲和力必须适中，一方面亲和力要足够诱导T细胞的活化和对肿瘤细胞的杀伤作用，另一方面亲和力又不能高到对有抗原低表达的组织产生毒性以及过度激活导致的自身耗竭和死亡。此外，为了优化CAR分子与其靶抗原的结合，必须考虑其他因素，例如表位位置、靶细胞上的配体密度以及单个配体结合域的亲和力等。 

除了简单地识别和结合目标表位外，scFv的其他特征也会影响CAR功能。例如，V_H和V_L两条链之间的相互作用方式以及互补决定区的相对位置都会影响CAR分子对其目标表位的亲和力和特异性。而目标表位的结构、空间可用性和功能方面也需要考虑在CAR分子的设计中。 

最后，免疫原性也是必须考虑的因素。利用杂交瘤技术制备的鼠源单克隆抗体（mAb）具有较强的免疫原性，可被人体免疫系统视为抗原，触发免疫系统介导的排斥反应，甚至引发严重的免疫疾病。因此，scFv的人源化有助于提高CAR-T细胞的安全性和治疗潜力。 

总结来说，scFv的亲和力、特异性、目标表位和免疫原性这四个特征对于CAR-T分子的设计至关重要。 

铰链或间隔区由CAR分子的非抗原结合细胞外区域组成。铰链区的功能是提供克服空间障碍的灵活性，允许抗原结合域进入目标表位。铰链区的长度和组成的差异会影响CAR分子的表达、柔韧性，以及信号传导、表位识别等，最终影响CAR分子的功能。因此，必须针对每个特定的抗原结合域进行量身定制，从而确定最佳的铰链区结构。 

跨膜结构域负责将CAR分子的细胞外结构域与细胞内结构域连接起来，从而将配体识别信号转导至细胞内。由于跨膜域经常根据细胞外间隔区或细胞内信号传导域的要求而变化，因此在设计CAR分子时必须考虑到这些因素。 

CAR分子中的共刺激结构域负责给T细胞提供第二个激活信号。最常见的共刺激域是CD28和4-1BB，CD28共刺激因子可诱导更强烈的急性反应，但其作用持久性有限；而4-1BB因子的激活能力较低，却具有较高的长期持久性。 

T细胞受体（TCR）在细胞内与CD3二聚体密切相关，后者携带基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM），ITAM在被淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶（LCK）磷酸化后启动T细胞激活信号。多年来，CD3ζ链已被用作标准的CAR分子信号转导结构域，而ITAM的数量及位置等因素也可为CAR分子的设计提供信息。 

三、迭代进化中的CAR分子

根据胞内结构域设计的不同以及引入细胞因子和配体的差异，CAR分子目前可分为五个不同的代次（图2）： 

图2 CAR分子的迭代^[1,2] 

上世纪八十年代末，Zelig Eshhar团队^[3]大胆地将抗体scFv与CD3ζ直接融合成一个蛋白质，且证明表达这样融合蛋白的T细胞能传导信号、分泌白细胞介素并在体外杀死表达特定抗原的淋巴瘤细胞，至此第一代CAR-T产生。由于没有共刺激域，第一代CAR-T的信号传导效率低下，并且体内增殖能力较弱、存活时间都较短，最终未能在临床应用中获得预期的疗效。 

科学家在第一代CAR-T的基础上引入了一个共刺激域（CD28或4-1BB），增强了T细胞对活化信号的响应能力，并且在临床治疗中展现了令人惊喜的治疗效果。目前上市的CAR-T药物均为二代产品，如Kymriah和Yescarta等。 

第三代CAR-T在第二代的基础上引入了两个共刺激域（CD28和4-1BB），以期望达到更好的信号传导的效果。然而共刺激信号不是简单的相加，增加多个共刺激因子也可能因为改变CAR-T胞内段结构域的长度而导致原有的信号减弱或不能传递。因此这种方法提供的临床益处仍存在争议。 

为了增强CAR-T细胞的功能，第四代CAR-T引入了一个细胞内结构域共表达一些小分子物质（如促炎症细胞因子IL-12），能够触发由细胞因子诱导的信号或者阻断影响CAR-T细胞功能的一些信号通路，以期收获更强的疗效。 

第五代CAR-T即通用型CAR-T，是指从健康志愿者获取T细胞并进行基因编辑敲除相关基因，然后转入CAR基因制成的CAR-T细胞，最主要的优势在于不需要从患者体内获取T细胞进行定制，而是可以做到现货供应，从而节约时间和治疗花费。 

四、总结

CAR分子结构的每个模块都独立并协同地影响CAR-T细胞的功能。一般来说，尝试在scFv和共刺激分子方面进行改造是CAR分子设计和优化的切入点。除了以上提到的五代CAR以外，还有其他基于不同目的的新颖CAR分子也被设计出来，例如针对抗原丢失的双价串联CAR、特异性识别健康组织的抑制性CAR、携带自杀基因以提高安全性的CAR等等。然而，也有研究证明铰链区和跨膜域可能是CAR分子设计的重要潜在组成部分，对于改善基于CAR的抗肿瘤功能至关重要。由于CAR分子的设计环节涉及到多个组分，使得CAR优化过程难以测试，因此必须进行系统的评估和考量，为合理设计下一代CAR-T细胞指明方向。