摘要：繁殖与营养状况和能量储备密切相关。在哺乳动物中，瘦素被认为是能量平衡和生殖之间的联系。然而，它在鱼类繁殖中的作用仍不清楚。在这项研究中，我们使用功能丧失的瘦素受体 (lepr) 品系研究了瘦素在斑马鱼繁殖调节中的可能作用。瘦素信号受损导致雌性斑马鱼严重的生殖缺陷。与野生型雌性相比，lepr突变雌性产卵明显减少，受精率低。卵泡发生不受影响，但 lepr 突变体中卵母细胞成熟和排卵被打乱。有趣的是，突变雌性垂体中促黄体生成素β（lhb）的表达显著降低。对卵巢和分离的成熟卵泡中候选基因的分析显示，突变体中参与类固醇生成、卵母细胞成熟和排卵的基因表达差异，已知这些基因受LH信号调节。此外，通过给予人绒毛膜促性腺激素，可以部分恢复lepr突变体的生育能力低下。我们的结果表明，瘦素缺乏并不影响卵泡发育的早期阶段，但瘦素可能在后期阶段是必不可少的，例如在卵母细胞成熟和排卵过程中。据我们所知，这是首篇有关瘦素与斑马鱼的生殖缺陷的研究。

关键词：瘦素  斑马鱼  生殖  促黄体生成素  排卵  卵母细胞成熟

简介：与其他脊椎动物一样，鱼类的繁殖是一个需要能量的过程，由脑-垂体-性腺 (BPG) 轴协调。硬骨鱼可以将其近一半的能量储备用于维持正常的生殖功能，而用于生殖的能量消耗水平在雌性中通常较高，用于产生卵子，而雄性的精子生产通常需要较少的能量。BPG轴的功能由几个代谢因素控制，这些因素可以直接或间接作用于轴的所有三个水平。在哺乳动物中，其中一个因素是脂肪细胞衍生的激素瘦素，这是一种由肥胖 (ob) 基因编码的 16kD 蛋白质产物，主要但不完全在白色脂肪组织中产生。瘦素通过其受体 (lepr) 介导其信号，该受体属于 I 类细胞因子受体家族。瘦素是体重、食欲和新陈代谢的关键调节剂，对哺乳动物生殖系统至关重要。缺乏功能性瘦素会阻碍青春期发育并导致不育，如瘦素缺乏的ob/ob小鼠。尽管哺乳动物和硬骨鱼瘦素基因具有低水平的同源性，但蛋白质的二级和三级结构以及基因同线性似乎是高度保守的。近几十年来，硬骨鱼瘦素的研究主要集中在食欲、食物摄入和能量代谢方面，而有关其在生殖方面作用的信息仍然有限。几项研究表明，瘦素在鱼类成熟过程的后期可能很重要。 例如，雄性和雌性香鱼产卵期间和产卵后的血浆瘦素水平较高。北极红点鲑肝脏中的瘦素 mRNA 季节性增加，在秋季达到峰值，此时所有鱼类也都性成熟。在雌性大马哈鱼中，将鱼从海水转移到淡水后瘦素的转录物和血浆水平与性类固醇水平的增加有关，刺激性成熟。此外，与未成熟鱼类相比，成熟雄性大西洋鲑鱼的肝脏lepa-1转录物更高。雄性鲭鱼在青春期过渡期间肝 lepa 表达也上调，但雌性鲭鱼没有。在整个精子发生的中后期也观察到雄性大西洋鲑睾丸中 lepr 转录物的显著上调。在最近一项关于雌性鲐鱼的研究中，瘦素刺激强烈诱导性腺激素分泌，促进卵巢发育，并触发雌性的青春期开始，这表明瘦素是激活生殖轴的重要信号。到目前为止，关于瘦素在斑马鱼繁殖调节中的作用知之甚少。斑马鱼有两个瘦素基因（lepa和lepb），分别主要表达于肝脏和性腺，还有一个单一的lepr基因，在大脑和睾丸中表达最强。在Michel等人的一项研究中，缺乏功能性lepr的成年斑马鱼表现出正常的生育能力，该突变型既不影响受精卵的产卵数量，也不影响成功繁殖的频率。根据我们的实验室观察，交配的雄性和雌性lepr突变斑马鱼没有或很少有可存活的后代。在本研究中，我们旨在利用功能丧失的lepr斑马鱼品系，深入了解瘦素在成年斑马鱼繁殖调节中的作用。我们的数据表明，缺乏瘦素信号会导致雌性斑马鱼的生育能力受损。我们提供的证据表明 lepr 突变斑马鱼的黄体生成素 (LH) 转录水平较低，这也导致排卵卵泡的比例较低。与野生型雌性相比，参与类固醇生成、卵母细胞成熟和排卵的基因在 lepr 突变体中表现出差异表达，这表明瘦素在斑马鱼卵母细胞成熟和排卵的最后阶段起着至关重要的作用。

lepr缺乏导致雌性生育能力受损：与对照组的野生型雌性相比，突变体雌性的产卵频率较低，产卵量也显著减少，无论是在总产卵量还是每次产卵量上，尽管无统计学差异。变异品系雌性产下的卵中，有很多质量很差，外观呈黑色，但在对照组中则不明显。与对照组相比，该组的受精率也较低。但受精胚胎的存活并没有受到影响。与对照组相比，与lepr突变雄性交配的野生型雌性在测量的生育参数上没有表现出任何差异。总之，瘦素信号受损对斑马鱼的雌性生育能力有明显影响，而在雄性中，精子形成没有受到影响。

图 1、 野生型和lepr突变型雌性斑马鱼的生育力评估

lepr缺乏对雌性的体型和体重没有影响：lepr 突变雌性斑马鱼的体型比野生型雌性斑马鱼长，但两种基因型之间的体重和体重指数均未发现显著差异。

图 2、 lepr+/+和lepr−/−成年雌性斑马鱼的标准体长 (A)、体重 (B) 和体重指数 (C)。

lepr缺乏雌性斑马鱼的卵泡发生不受影响：组织学分析表明野生型和lepr突变型斑马鱼的卵巢中都可以识别出所有不同阶段的卵泡[初级生长（PG）、前卵黄形成（PV）、早期卵黄形成（EV）、中期卵黄形成（MV）完全成熟（FG）]。与对照组相比，lepr突变鱼卵巢中EV和FG卵泡的比例略高，但不显著高于对照组，且两种基因型之间卵泡发育不同阶段的比率无统计学显著差异。在卵泡生长过程中，卵黄素在雌二醇的控制下在肝脏中合成，通过血流输送到卵巢并被生长中的卵母细胞吸收。在肝脏中测量了所有已知的雌激素受体亚型（esr1、esr2a、esr2b）和卵黄蛋白原基因家族的两种亚型（vtg1、vtg2）的表达。在两种基因型之间，这些基因的mRNA表达没有显著差异。综上所述，这些结果表明lepr缺乏对斑马鱼卵黄发生和卵泡发生均无影响。

图 3、lepr+/+ (A) 和 lepr-/- (B) 成年雌性斑马鱼卵巢的组织学。

lepr 缺乏降低 lhb 转录：脑中促性腺激素释放激素（GnRH）亚型（gnrh2，gnrh3）及其受体和垂体中卵泡刺激素（FSH）（gnrhr2，gnrhr3，fshb）的mRNA表达在野生型和lepr基因敲除雌性之间没有显示出任何显著差异。然而，突变雌性的垂体中的促黄体激素 (lhb) 转录物显著降低。在大脑和垂体中，两组之间的lepr mRNA表达没有差异。

卵巢组织和成熟卵泡中的差异基因表达：对成熟卵泡进行取样的过程中，我们观察到，与野生型雌性相比，lepr突变雌性的卵巢形态更加异质：lepr突变雌性的卵巢以完全或部分无排卵为特征，而野生型卵巢的排卵正常。因此，将突变体的完全生长卵泡分为两组：完全不排卵的鱼和部分排卵的鱼。为了进一步分析lepr突变雌性中观察到的生育能力受损的分子机制，在lepr突变雌性的整个性腺和分离的成熟卵泡中评估了一组参与最终卵母细胞成熟和排卵的基因的表达谱，包括瘦素系统的基因，并与野生型雌性斑马鱼进行了比较。

图 4、lepr+/+ 和 lepr−/− 成年雌性斑马鱼的卵巢形态。

促性腺激素受体：lepr突变体和野生型斑马鱼卵巢中fshr和lhcgr的表达没有差异。有趣的是，与完全不产卵的突变雌性相比，产卵的突变雌性成年卵泡中lhcgr的转录物显著更高。

类固醇酶：与野生型雌性相比，lepr突变雌性卵巢中的star和hsd3b1转录物更高。与未产卵的突变雌性相比，产卵的突变雌性成熟卵泡中 hsd3b1 的表达也显著升高。孕酮膜受体：lepr突变体和野生型斑马鱼卵巢中mpra1（paqr7a）的表达没有差异。然而，与未产卵的突变雌性相比，其在正在产卵的突变雌性成年卵泡中的表达明显更高。两种基因型的卵巢或成熟卵泡中mpra2（paqr7b）的转录本均无差异。与突变体相比，野生型鱼类卵巢中的mprb（paqr8）转录物更高，尽管不显著。孕酮受体膜成分：卵巢中 pgrmc1 的表达在对照组和突变组之间没有差异。然而，野生型斑马鱼卵巢中的pgrmc2转录物高于lepr突变斑马鱼卵巢中的pgrmc2转录物。野生型鱼类和两个突变组在成熟卵泡中未观察到两个基因的显著差异。孕酮核受体：与对照组相比，突变斑马鱼卵巢中pgr的表达水平几乎高出2倍。与未产卵的突变雌性相比，产卵的突变雌性的成熟卵泡中观察到显著更高的转录物。前列腺素及其受体：两种突变型之间催化斑马鱼前列腺素合成的环氧化酶（ptgs1、ptgs2a和ptgs2b）的转录物均无显著差异。然而，ptger4b（一种已被证明在斑马鱼排卵中必不可少的前列腺素受体）的转录本在突变雌性的卵巢中显示出显著更高的水平。野生型鱼类和两个突变组之间，在成熟卵泡中未观察到上述所有基因的显著差异。金属蛋白酶： mmp2 和 mmp15a 转录物在 lepr 突变体卵巢中上调，尽管差异仅在mmp15a中显著。在成熟卵泡中未观察到这些基因的表达差异。其他测定的金属蛋白酶（mmp9、mmp14b、adamts1、adamts9）也没有发现差异。其他参与卵母细胞成熟和排卵的基因：与对照组相比，突变斑马鱼卵巢中 cpla2 的表达水平显著升高。相反，野生型斑马鱼卵巢组织中 ybx1 的表达高于 lepr 突变鱼的卵巢组织。当在完全生长的卵泡样本中测试这些基因时，没有观察到显著差异。卵巢和成熟卵泡中ctsl1、timp2b和mettl3的表达在各组之间没有差异。瘦素系统基因：lepr和lepb的转录物在卵巢和发育成熟的卵泡中均有表达，但在不同基因突变型之间的表达没有差异。

hCG可部分恢复 lerp-/- 雌性斑马鱼的生育能力低下：为了研究在 lepr 突变体垂体中观察到的 LH 水平较低是否可能是导致生育能力低下的因素之一，lepr-/- 雌性斑马鱼腹膜内注射了 LH 激动剂 hCG。事实上，在给予 hCG 后，在lepr-/- 斑马鱼的卵巢中观察到排卵卵泡数量显著增加。当 lepr-/- 雌性与野生型雄性交配时，hCG使产卵成功率提高了 25%。这些结果进一步支持了我们最初的假设，即低排卵率可能是由 lepr 突变体中 LH 水平降低引起的，而产卵可能仅部分受 LH 信号的影响。

结论：我们的研究表明，瘦素信号受损会导致雌性斑马鱼出现严重的生殖缺陷。与野生型雌性相比，lepr 突变雌性lhb表达较低，这一发现表明瘦素可能在垂体水平调节LH，这在其他脊椎动物中也可以观察到。这一假设进一步得到了以下发现的支持：突变雌性的排卵障碍可以通过服用hCG来挽救。由于瘦素信号受损，LH水平降低将导致类似于lhb基因敲除斑马鱼的表型，在这种斑马鱼中，卵泡发育正常，但卵母细胞无法成熟并从卵巢排卵。此外，硬骨鱼类中受LH调节的几个与类固醇生成、卵母细胞成熟和排卵相关的基因在lepr突变雌性的性腺中有差异表达。据我们所知，这是将瘦素与硬骨鱼物种的生殖缺陷联系起来首次体内研究。 然而，我们对瘦素在鱼类繁殖中的作用的理解仍然有限。到目前为止，在硬骨鱼的性腺水平上受损的瘦素信号传导的直接影响仍然未知。对野生型和lepr突变斑马鱼卵泡发育的不同阶段进行全面的转录组分析可以对可能的机制提供更多的见解。

原文出自：Impaired leptin signaling causes subfertility in female zebrafish - ScienceDirect