小鼠模型
1.病毒及攻毒 Zaire亚型小鼠适应株,攻毒剂量为100pfu(3000 LD50),腹腔注射。
2.实验动物 8周龄SPF级BALB/c小鼠。
3.实验环境 BSL-4级实验室。
4.实验步骤 每天观察动物的一般状况,包括眼、鼻、口、脸、耳、爪、四肢、肛门、尾、被毛、活动和精神状况。攻毒后每天称重1次,攻毒后1~5d每天安乐相同数量的小鼠(3~10只),取血及如下组织:淋巴结(包括下颚、肠系膜、及膝后窝部)、纵隔膜、脾、肝、肺、心、脑、肾、部分胃肠道、生殖系统、胸腺、肾上腺、及骨髓。同时设立未攻毒小鼠对照。
5.病毒分离 解剖时取如上组织,研磨处理后接种Vero细胞,每天观察细胞病变。
6.病毒RNA的检测 取如上组织放入1ml裂解液(Qiagen)中,用研磨器充分研磨,离心后取上清放入buffer RLT(已加入1%巯基乙醇)350μl,4℃,13000转/分离心3min,将上清转移至新1.5ml微量离心管中。提取样品病毒核酸,再将RNA反转录成cDNA,通过荧光定量PCR仪直接测定病毒核酸载量。
7.病毒抗体检测 动物在不同时间点处死采血分离血清,-80℃下保存备用,用特异性ELISA试剂盒对抗体进行检测。
8.病理观察 解剖时取如上组织,详细观察各组织的形态变化,并将各组织用10%甲醛固定,石蜡包埋,常规病理组织切片处理后,HE方法染色后,镜检观察。
9.建模结果 小鼠于攻毒后3d开始发病,5~7d后死亡,死亡小鼠的肝及脾内均可检测到效价高达10的9次方pfu/g的病毒。同时,肝和脾发生的病理改变,以及血清中的转氨酶(天冬氨酸转氨酶,AST;丙氨酸转氨酶,ALT)水平,与被ZEBOV攻毒的灵长类动物模型的病理表征极为类似(图14-6、图14-7、图14-8、图14-9和图14-10)。然而,与灵长类相反的是,小鼠组织中仅有少量的纤维蛋白沉淀,并且仅腹腔攻毒可致死小鼠,当使用其他攻毒途径时,即使加大攻毒剂量,小鼠仍能存活。