在从事CAR-T细胞治疗研发的路上，小赛也在打磨自己的「医药养成笔记」，把遇到过的问题都认真整理出来，同时，小赛也准备了「细胞治疗完整解决方案」，包括了CAR分子的设计、慢病毒包装、CAR-T细胞构建、体外体内杀伤验证等多个重要环节，致力于为广大研发人员的项目出谋划策。扫码即可免费领取电子版，快来一键获取干货吧！ 

「医药养成笔记」精选放送

——part1：「靶细胞的构建」相关问题 

Q1：选定适应症和靶点，却缺乏合适的天然肿瘤细胞作为靶细胞，这种情况应该怎么选择靶细胞？

这种情况下可以选择构建相应的稳转细胞株，细胞株种类的选择上还是尽量和所研究的适应症一致，例如研究的适应症为肝癌，就可以选择相应的肝癌肿瘤细胞系来进行稳转株构建，这样构建的稳转株细胞也可以用于下游的体内抗肿瘤活性评价实验。另外，如果仅做一些简单的抗肿瘤活性评估和特异性验证工作，也可以选择293T和CHO-K1这一类比较常用的工具细胞，这类细胞易于被慢病毒感染，因此很容易获得稳转细胞，可以节省时间成本。 

Q2：进行双特异性CAR-T的相关研究，但缺少双靶点共表达的细胞系，如何解决靶细胞的选择问题以及验证所构建的CAR-T细胞的特异性问题？

为解决肿瘤细胞靶点抗原表达的异质性以及CAR-T细胞治疗过程中存在抗原逃逸问题，双特异性CAR-T的研究也越来越多。在没有适合的用于双靶点CAR-T细胞研究的靶细胞的情况下，可以通过构建稳转细胞株来解决，用于构建稳转细胞株的细胞需尽可能来源于所研究的适应症的肿瘤细胞。为研究双特异性CAR-T细胞的功能，也可以构建表达单抗原以及双抗原的细胞株，这样通过体外对这些细胞株的裂解作用，可以在一定程度上评估双特异性CAR-T细胞的特异性。 

Q3：如何解决稳转细胞株表面抗原丢失的问题：用CD20编码慢病毒转染293T细胞构建了一株293T-CD20稳转细胞株，但是在培养过程中发现CD20的表达时高时低。

稳转细胞株如果带有真核抗性的话可以加入相应的抗生素来维持，但抗生素的加入量需要进行优化才能取得比较好的维持效果；如果不具有真核抗性，可以通过流式分选进行几轮富集，这样可能能够解决稳转细胞抗原丢失的问题；另外可以通过挑克隆的方式，筛选获得抗原稳定表达的细胞株。 

Q4：做CAR-T细胞治疗肿瘤方面相关的研究时，如何选择合适的靶细胞来证明CAR-T细胞抗肿瘤效果的特异性？

可以选择靶抗原表达和不表达的细胞株，然后用CAR-T和对照T分别杀伤这两种细胞，依据杀伤结果来判断CAR-T细胞的抗肿瘤效果是否具有特异性。