在小鼠基础知识系列六中，J博士为大家介绍了什么是 Cre-Lox，而在接下来的基础知识系列里，J博士将继续为大家介绍以下几个方面的内容： 

小鼠基础知识系列七：小鼠配繁和鉴定策略（本文）
小鼠基础知识系列八：Tamoxifen诱导型cre
小鼠基础知识系列九：四环素诱导型cre 
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一般来说，Cre小鼠和Floxed小鼠是两个不同的品系，通过配繁的方式将它们整合到同一只小鼠身上。那么正确且快速的配繁策略是什么呢？繁育后得到的后代小鼠又如何鉴定以挑选出目标基因型呢？在今天的课堂上，J博士将围绕着这两个问题展开。  
01 小鼠配繁策略
▲ 条件性敲除小鼠（conditional knockout, cKO） 
cKO小鼠通常需要把两个等位基因全部删除，才能达到基因敲除的目的，所以其floxed等位基因的基因型应该为纯合。而一般情况下，我们在使用cre时往往选用半合子的形式。这是因为：第一，保证cre基因的拷贝数一致，避免重组效率不同导致实验可重复性差；第二，有时cre基因的构建为转基因随机插入的形式，可能会破坏内源基因的表达，使用半合子在一定程度上可以避免转基因插入效应带来的影响。所以，cKO小鼠的目标基因型一般为cre/+;flox/flox，通常在F2代才能获得该基因型小鼠。
例如：B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J, 该品系是由mouse Albumin增强子/启动子驱动的Cre小鼠，与floxed小鼠配繁，可以靶向肝脏组织进行特异性敲除。产生Cre/lox肝脏组织特异性敲除的最高效的育种方案如下：首先如图1，为了产生杂合子的floxed等位基因和半合子的Alb-cre转基因小鼠品系，将感兴趣的纯合子floxed小鼠与Alb-cre转基因小鼠株系交配。大约50%的后代为floxed等位基因杂合子，cre转基因为半合子（cre/+;flox/+）。 

将这些小鼠与纯合子的floxed小鼠配对(见下图)。这种交配产生的后代中，25%的小鼠为携带Alb-cre的floxed等位基因的纯合子小鼠。这些就是需要的实验小鼠。这类小鼠在肝脏中，感兴趣的等位基因被全部敲除，但在肝脏以外的组织只是携带LoxP位点，并不影响基因的表达。 

通常来说，根据所需基因型和原始品系的基因型，即可推算出合适的配繁策略。上述方法是理想的较为高效的方法，但在实际实验中，还需要具体案例具体分析。 
此外，需要注意的是以下几点： 
① Cre基因是否和floxed小鼠在同一染色体，是否会发生连锁反应。在选择品系的时候，尽可能选择Cre和floxed基因在不同染色体上的品系；
② 在配繁过程中cre/+;flox/flox小鼠是否可以存活和可育；
③ 我们往往还需要在配繁中得到同窝对照小鼠，因此在设计配繁策略时也要考虑到这一点。比如下表中，选用不同的对照鼠推荐的亲本小鼠基因型（不考虑致死或不育现象） 

  ▲ 条件性过表达小鼠
Cre/lox系统除了可以用来条件性敲除内源基因，也可以用来条件性过表达基因。在启动子和转基因编码序列之间适当插入“loxp-STOP-loxp, LSL”序列(转录终止元件)，用以阻止基因的表达。Cre重组酶可以去除loxp位点间的终止元件，因此基因只在具有Cre活性的细胞中表达。与cKO条件性敲除小鼠两条等位基因都需要纯合不同，条件性表达小鼠通常只要有1条等位基因携带突变即可满足实验要求，因此基因型通常需是Cre/+;flox/+，在F1代即可获得目的小鼠。
例如：使用STOCK Tg(MMTV-cre)4Mam/J（#003553）cre小鼠和B6.129S4-Krastm4Tyj/J（#008179）floxed小鼠进行杂交，如下图。只需要将他们杂交一代，得到的F1代就可以在乳腺中敲除LSL元件，进而特异表达Kras*G12D点突变基因。如果表达的基因是GFP荧光或者LacZ等显色基因，常常作为报告小鼠品系用来确认Cre的特异性。 

 
02  Cre-Lox小鼠鉴定
我们以基因敲除为例，介绍Cre-Lox小鼠的相关鉴定。首先需要鉴定小鼠是否为目标基因型。cKO小鼠的目标基因型是Cre/+; flox/flox, 此时同时使用原始Cre品系和floxed品系的基因型鉴定方法即可。需要注意的是，如果使用了全身表达Cre，则需重新设计floxed基因敲除后的引物方可实现鉴定。 
除此以外，我们往往还要鉴定小鼠基因功能上的敲除是否成功，这可以根据研究需求在不同水平进行分析： 
▲ 基因组水平：由于发生基因敲除后，基因片段发生改变，可以利用PCR产物大小差别来进行鉴定。提取目标组织的DNA，通过特定的引物进行PCR鉴定。比如下图介绍了基因敲除后的引物设计策略： 

▲ 转录水平：基因片段被敲除后，该基因的转录也可能收到影响。提取目标组织的mRNA并反转录，设计相关基因以及内参基因的qPCR引物，利用qPCR实验鉴定该基因转录水平上是否改变。应注意，敲除基因的引物尽量设计在被敲除的外显子或其后的外显子上。 
▲ 蛋白水平：基因敲除最主要的目的就是造成基因功能的缺失，即蛋白表达的缺失。提取目标组织的蛋白进行Western-blot检测，以鉴定相关基因对应蛋白的表达情况，或利用免疫荧光/组化对组织切片进行蛋白表达水平检测。