如前文《实验动物的常规眼科检查》一文中所写，眼科检查的操作流程可因动物种属和特点的研究目的而异。如果目的是筛查药物等物质对眼部组织的不良影响，则应至少进行间接检眼镜和裂隙灯显微镜的检查。根据检查目的，也可执行其它程序，比如角膜染色、角膜知觉检查、角膜厚度测量、眼压计、眼底照相、荧光血管造影、光学相干断层扫描 (OCT, Optical Coherence Tomography) 和视觉系统的电生理评估（例如视网膜电图、多焦视网膜电图、视觉诱发电位）。

许多无创性眼科诊断技术，可同时提供眼前节与眼后节的结构和功能信息。下面讨论了其中一些技术，对这些技术适用于毒理学、眼科研究和临床应用的场景进行了初步讨论。

01 眼压测量

眼压计用于获得眼内压 (IOP, Intraocular Pressure) 的间接测量值。市面上有几种不同的商品化的手持式设备，其便携性足以供眼科检查人员使用，如压陷、压平或回弹式眼压计。对于合同研发组织（CROs, Contract research organizations）使用的多种动物种属，通常认为Schiotz压陷式眼压计的结果不准确、不可靠，因此不应用于眼部毒理学研究。由于许多眼压计最初设计用于人的角膜，用于动物的读数可能略不准确，但如果在整个研究期间由同一名检查者使用相同的眼压计，则研究中发生的眼压变化将是有效的。

大多数实验动物的 IOP 范围为 12-25 mmHg，双眼之间的差异应≤5 mmHg。IOP 可受到多个变量的影响，如：保定技术、动物应激、昼夜节律眼位、镇静或麻醉、角膜厚度等。如果可能，在进行眼压测量时，应在整个研究期间保持如下细节的统一：每天相同的测量时间、相同的眼压计和操作技术、同一组检查人员和保定人员，来测量试验内所有动物的 IOP。应在散瞳之前测定眼压。当眼压测量是研究的关键点时，建议研究开始前先对动物进行保定适应和操作适应。

最常使用的是压平式眼压计，如Tono-Pen XL®、Tono-Pen Vet®、Tono-Pen AVIA® ，或非接触式眼压计。眼压测量需表面麻醉时，0.5% 丙美卡因是最常见的选择。该技术测量压平角膜给定区域所需的力，然后将该施加力转换为眼压值（单位：mmHg）。一些压平式眼压计具有自我校准的优势（图1），而非接触式眼压计可提供纸质副本用于记录保存，两者都是药物非临床研究质量管理规范（GLP，Good Laboratory Practice）类研究的理想技术。Tono-Pen XL 和 Tono-Pen Vet® 产生4个独立读数，可对读数取平均值，并显示IOP和误差百分比，即单个读数之间变异性。Tono-Pen AVIA® 产生10 个独立读数，并以置信度百分比报告 IOP 和变异性。对于 Tono-Pen XL®，误差百分比应<5%，而对于 Tono-Pen AVIA®，置信度百分比应 >95%。

图1  Tono-Pen AVIA Vet® 用于测量Dutch Belted Rabbit的眼压

回弹式眼压计通过向角膜发射一个小的塑料探针头来确定眼压，然后探头反弹回设备中，产生感应电流，由此计算眼压值。为了准确测量，探针必须以水平位置在角膜上击发，即探针与地板平行。实验动物最常用的回弹眼压计是 Tonovet®（图2a）。Tonovet® 专门针对犬、猫和马进行了校准，但也已在其它种属中可靠地使用。TonoLab 眼压计是专门为小鼠和大鼠设计和校准的（图2b）。在许多实验动物中，包括犬、兔和大鼠，Tonovet 和 TonoLab 眼压计具有不需要局部麻醉的优点，并且比 Tono-Pen® 更容易获得 IOP，其缺点是在使用前不能自行校准。与 Tono-Pen® 和 Tonovet® 一样，它也取6 个读数的平均值，并使用眼压值的左侧栏指示误差百分比。测量时，应没有错误栏，或者栏应该位于屏幕的左下角，以使读数可以接受。

无论使用何种眼压计，通常每只眼应获得并记录至少 2-3 个最终平均读数。由于除非接触式外的所有眼压计仅给出数字读数，设备不会创建永久性记录，因此必须手动记录 IOP 或将其输入计算机数据库中。

图2  (a) The Tonovet® 回弹式眼压计测量New Zealand white rabbit眼压  (b) TonoLab 眼压计小小的尖端可用于啮齿类的眼压测定

02 角膜厚度测量法

角膜厚度测量法是一种无创性评价角膜厚度的方法。 最常使用专门为此目的设计的接触式超声设备（例如 PachPen®）进行（图3），但也可以通过高分辨率超声检查或光学相干断层扫描（OCT, Optical Coherence Tomography）获得角膜厚度的测量结果。在角膜水肿可被生物显微镜检测出之前，角膜厚度测量法可对角膜厚度的细微变化进行评价。角膜厚度可因种属的不同，以及角膜区域不同（轴向或周边）而变化。由于区域差异，必须在每个时间点从角膜的相同区域进行测量，通常选用轴向。

图3  PachPen 测量New Zealand white rabbit角膜厚度

03 荧光素染色法

在涉及眼局部给药、角膜接触镜评价的研究，和使用改良 Hackett-McDonald 评分系统的其他研究中，通常使用荧光素钠溶液评价角膜上皮的完整性。荧光素是一种水溶性荧光染料，可被亲水性角膜基质保留，但不被角膜上皮保留。它可用于辅助识别角膜上皮缺损，也可用于评价角膜前的泪膜滞留。荧光素以单个浸渍条带的形式提供，使用时使用无菌生理盐水润湿。将湿润的条带轻轻涂抹在背侧球结膜上，注意不要接触角膜。然后使用盐水轻轻冲洗多余的荧光素。或者，可将荧光素条置于塑料注射器中，并加入预定体积的无菌生理盐水，以产生已知荧光素浓度的溶液，然后滴在角膜上。由眼科检查人员使用带有钴蓝滤光片的生物显微镜对角膜进行检查，观察是否有残留的荧光。

04 眼部照相

眼部照相可用来证明眼底等区域无变化，或记录异常以及监测病变的进展。可在研究期间的不同时间点拍摄照片来进行比较，以准确地确定异常是静态的还是进行性的。由于照相增加了额外的时间、成本和动物应激，因此并非所有研究均需进行。在观察到病变时，或很可能引起眼部异常的研究中（例如眼内植入物，玻璃体内或视网膜下注射研究），可在研究方案中将其作为一种记录病变的选择。

眼部照相可分为眼外部和眼内部。眼外部的拍摄可使用带有微距透镜的标准单镜头反光（SLR, Single Lens Reflex）数码相机，或带屈光度设置调节以允许眼外部和眼前节成像的数字 Kowa Genesis-D 眼底照相机。眼后节的拍摄需要特定类型的眼底照相机，数字化Kowa Genesis-D 照相机、RetCam、Phoenix Micron IV 和 Micron X 适用于大多数实验动物的拍摄（图4）。这些照相机可适用于间接眼部照相、啮齿类动物眼底照相和荧光血管造影。眼底照相的优点是能够永久保存记录，以比较潜在的研究相关结果，如果有发现，则可由另一名眼科检查再次进行独立审阅。

在拍摄照片时，所有照片都应使用相同的放大倍率和照明设置。此外，所有动物均应按相同眼别顺序（左和右）进行拍摄，同时应保存动物标识和设备日志等拍摄记录。上述标准也可作为标准操作规程 (SOP, Standard Operating Procedures) 的一部分。

图4  可用于实验动物的眼底相机

05 荧光血管造影

荧光血管造影可用于评价眼内动脉和静脉的血管完整性。虽然其最常用于检查视网膜和脉络膜的血管，但也可用于检查虹膜血管。在毒理学研究中最常用于评价供试品对于新生血管形成的影响。目前，它已被应用于多种实验动物，最常选用的是10%荧光素钠，也有部分研究选择吲哚菁绿。

荧光血管造影技术需要散瞳，并进行镇静或麻醉。将光可激发的化合物荧光素静脉注射，可获得目标组织（脉络膜视网膜和虹膜）的一系列定时图像。与荧光素注射相关的并发症可能包括渗漏后组织刺激、呕吐和过敏反应。必须在能够拍摄多幅、快速排序图像的眼底照相机上使用激发滤光片 (490 nm) 和屏障滤光片 (520-520 nm)。Kowa Genesis-Df、RetCam Shuttle、Phoenix Micron X 和 Heidelberg Spectralis cSLO 可用于荧光血管造影，且是便携式的（图4）。在注射荧光素前，先拍摄对照的彩色图像，然后每 20s 拍摄一组，获得连续图像。由于荧光素填充脉络膜视网膜血管，因此描述了血管流动的各个阶段。它们包括动脉前期、动脉期、动静脉期、静脉期及后期。荧光血管造影观察到的异常可能包括血管异常（动脉瘤、新生血管形成）、荧光受阻、荧光素渗漏、低荧光和高荧光。

06 视网膜电图/视觉诱发电位

根据毒理学研究目的，以及可能受影响的视觉系统的特定方面，有多种电生理学试验可用于评价视网膜和视觉通路。视网膜电图 (ERG, Electroretinography) 是测量视网膜在受到光刺激时产生的电势。标准 ERG 是一种全视野刺激，可提供关于整个视网膜的信息，是视网膜色素上皮、光感受器和内层视网膜的群体反应。对于局部视网膜评价可选用多焦视网膜电图 (mfERG, multifocal electroretinogram)。对于黄斑区神经节细胞的评价可选用图形倒转视网膜电图 (PERG, pattern reversal electroretinogram)。而为了评价从视网膜到视觉皮层的整个视觉通路，视觉诱发电位 (VEP, visual evoked potential) 则是首选技术。在这些试验中，全视野 ERG最常用于临床前毒理学试验。ERG 提供了一种非侵入性的可重复评估视网膜功能的方法，它可结合间接检眼镜和组织病理学来对视网膜结构和功能进行综合评估。

ERG应在散瞳后按标准流程进行，目前人和犬的ERG有许多可参考的国际指南，可作为试验设计的参考。在获得全视野ERG过程中，如下条件建议保持一致：房间照明情况、暗适应、闪光强度、频率以及使用的镇静或麻醉剂剂量。

07 光学相干断层扫描

光学相干断层扫描是一种高分辨率的无创成像技术，可提供眼部结构的实时横断面图像，最常用于视网膜和视神经，其轴向分辨率为 2-10 μm，也可用于眼前节的成像。与许多先进的成像技术一样，它需要镇静或麻醉、散瞳和专门的设备。当进行 OCT 成像时，可看到所有的单个视网膜层，并测量其厚度，以便随时间进行定量和多次重复评价。其可测量视盘的杯面积、盘面积、杯直径、盘直径以及边缘面积。通过 OCT 对前节进行检查则可了解角膜、前房、虹膜和虹膜角膜角的结构信息，且其无需像超声生物显微镜 (UBM, ultrasound biomicroscopy) 所需的那样接触角膜。它还提供了比 UBM更高的轴向分辨率。OCT 在实验动物中已应用于多个种属，其在人类疾病动物模型和临床前试验中的应用也将越来越多。

随着技术的进步，频域 OCT (SD-OCT, spectral-domain OCT) 使用非机械技术，比传统 OCT 或时域 OCT (TD-OCT, time-domain OCT) 明显更快。SD-OCT 同时测量一个光谱中多个波长的反射光，因此被称为光谱域。SD-OCT 比 TD-OCT 快 100 倍，每秒可采集 70,000 + 次 A-scan，其扫描速度和次数的增加可转化为更高分辨率。

08 角膜内皮显微镜检查

角膜内皮显微镜可对角膜内皮细胞进行活体非侵入性的成像观察，可采用接触或非接触方法进行。一旦可视化，可评价角膜内皮细胞的细胞形态，并可定量为每 mm 的细胞数量 。正常角膜内皮细胞排列规则，呈六角形。内皮显微镜可评价细胞的密度、多形性和变异情况。由于细胞数量可因动物年龄和角膜区域的不同而变化，因此须使用相同年龄的动物对这些变量进行标准化，并检查轴向角膜。须对动物进行镇静或麻醉，以获得准确的图像，并可适用于简化技术的自动化系统。FDA 已经设立了关于临床试验中角膜内皮显微镜检查的指南，这些指南可以作为临床前研究设计的起点。除角膜内皮显微镜外，还可选用体内高分辨率共聚焦显微镜 (Heidelberg Retina Tomograph with Rostock Corneal Module) 进行角膜内皮成像和分析（图5）。

图5  Heidelberg Retina Tomograph (with Rostock Corneal Module)用于角膜内皮的成像和分析

小结

在本篇文章中，我们总结了在医药行业等研究场景中的非常规眼科检查的适当方法和技术。这些技术将在眼部毒理学领域中越来越普遍，技术人员可在研究过程中根据试验的设计和已发现的眼科学变化等关键因素，来选用进一步的检查办法。

参考文献

[1] Gilger B C, Cook C S, Brown M H. Standards for Ocular Toxicology and Inflammation [M].  2018.