众所周知，新冠病毒进入细胞是由S（刺突）蛋白介导的，S蛋白自组装成同源三聚体，在病毒表面形成特殊的花冠结构。S蛋白上的受体结合结构域（RBD）与宿主细胞的ACE2受体结合，因此可作为开发中和抗体的主要目标。 

研究人员推测，与原生结构相似的三聚体可能会增加RBD的免疫原性，因此，他们将六螺旋束（6HB）添加到RBD蛋白的C端，使其形成稳定的三聚体结构。6HB是一种热稳定的三聚体结构域，来源于HIV的gp41蛋白，在此作为“分子钳”以增加病毒蛋白的稳定性。他们选择杆状病毒系统来表达去糖基化的RBD蛋白（RBDΔN1）与6HB的融合体，因为去除糖基化位点可增加蛋白表达，并维持其抗原性和功能。 

三种重组杆状病毒的示意图 

重组杆状病毒rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB以及对照（RBD和6HB）的构建过程如图1所示。研究人员用重组杆状病毒感染sf9细胞后，开展Western blot分析，发现RBD-6HB蛋白在感染的细胞中有效表达。他们在收集培养上清液后进行蛋白纯化，获得了纯度高达97%的蛋白质。他们还发现，RBD-6HB蛋白能够形成三聚体（分子量约为120 kDa），这一点通过SDS-PAGE和Western blot得到了验证。 

之后，研究人员在hACE2人源化小鼠上评估了RBD-6HB三聚体的免疫原性，这种稳定表达人类ACE2受体的人源化ACE2小鼠是由赛业生物构建的。他们将6周龄的hACE2小鼠随机分为三组，将指定的蛋白和佐剂注射到小鼠体内。加强免疫后，他们发现RBD-6HB在氢氧化铝和CPG佐剂存在的情况下能够刺激小鼠持续产生高水平的抗体，且RBD-6HB组的抗体滴度高于RBD组（图2）。同时，与对照组相比，疫苗组小鼠的食量和活动情况无明显差异，表明疫苗的刺激性较小。 

在小鼠中接种疫苗后的血清抗体反应 

最后，研究人员还评估了RBD-6HB疫苗对小鼠的保护作用。他们将新冠病毒注射到hACE2小鼠体内。根据qPCR检测的结果，RBD-6HB+佐剂组中SARS-CoV-2的N基因表达量比6HB组低100倍，比RBD+佐剂组低50倍，这表明候选疫苗具有中和病毒的作用。同样地，RBD-6HB+佐剂组中SARS-CoV-2的E基因表达量也低于对照组，表明候选疫苗可能具有抑制病毒体内复制的作用。 

组织学分析显示，RBD-6HB组小鼠的肺组织表面被覆一层光滑的浆膜，显示完整的肺泡结构，无明显异常，而对照组则存在炎症细胞浸润，血管充血和肺泡扩张（图3）。这些结果表明，RBD-6HB疫苗能够建立有效的保护屏障，帮助小鼠抵御新冠病毒感染。 

RBD-6HB疫苗对hACE2小鼠的保护 

综上所述，三聚体结构的RBD-6HB蛋白在佐剂存在的情况下能够诱导机体产生特异性抗体。RBD-6HB疫苗对hACE2小鼠具有保护作用，有效降低了肺部的病毒载量，减少了炎性组织损伤。这项研究突出了RBD结构域在新冠疫苗设计中的重要性，为保护性疫苗的开发提供了理论基础。