动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种慢性疾病，也是引发其他心脑血管疾病的最重要的因素之一。动脉粥样硬化的病人脂质代谢紊乱，包括血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)水平升高和高密度脂蛋白(HDL)降低，HDL降低是心血管疾病的主要危险因素，HDL代谢异常在动脉粥样硬化中起重要作用。

肝X受体(Liver X receptors，LXRs)是孤核受体超家族成员，它包括两种同源亚型LXRa(NR1H3)和LXRb(NR1H2)。LXRs是机体保持胆固醇相对稳定的关键感受器。可通过促进胆固醇从外周组织的流出，增强胆固醇的逆转运；调节胆固醇在肝脏中的代谢和排泌；调控胆固醇在小肠的吸收和排泄来降低血浆胆固醇水平，从而发挥其抗动脉粥样硬化作用。

因此，本实验以小型猪作为实验动物。采用饲养高脂高胆固醇的方法制造动脉粥样硬化痰证的动物模型来研究肝X受体a(LXRa)和肝X受体b(LXRb)在动脉粥样硬化痰证发生、发展过程中的表达变化。

(一)造模

1.材料与方法

(1)实验动物  健康成年小型猪20头，雌雄不拘，体重20±5kg，清洁级实验动物，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供，预饲期15d，动物房温度保持在23±2℃左右，相对湿度保持在45％～65％之间。

(2)分组及方法  将20头小型猪随机分为3个组，正常组4头，喂养基础饲料；实验组分为2组，一组饲养1.5％胆固醇饲料(普通饲料加1.5％胆固醇和10％猪油)，共8头；另外一组饲养3％的胆固醇饲料(普通饲料加3％胆固醇和10％猪油)，共8头。动物分笼喂养，每日投食两次，日粮为体重的2％，自由饮水。正常对照组动物，喂养2个月后肌注氯胺酮8mg/kg麻醉，分离右侧颈总动脉，但不进行血管内膜损伤。饲养周期为12个月。

(3)血脂的测定  用氧化酶法测定血浆TC、TG、LDL、HDL的浓度，每2个月末称体重并从禁食过夜的小型猪前腔静脉采集血样，检测血脂浓度。

(4)动脉病变的形态学检查  制备主动脉组织切片，主动脉取出后纵行切开，10％福尔马林固定，苏丹Ⅲ染色，按主动脉内膜病变分级标准肉眼对主动脉内膜硬化斑定级，而后石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察。其中内膜表面粗糙，有大片苏丹Ⅲ着色极深的为病变组织。观察AS斑块的形成以及血管内膜的变化。

(5)统计学处理  实验所得数据采用平均数±标准差(x-±s)表示，两组间比较采用t检验，应用 SPSS11.0统计分析软件进行统计处理。

2.结果  实验结果显示实验组小型猪较正常组小型猪的血浆总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白含量明显升高，高密度脂蛋白含量明显减少。实验组的1.5％和3.0％组的血浆总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白含量也有明显差异，但在高密度脂蛋白含量上差异不大。小型猪腹主动脉经油红染色后可见正常组较1.5％组、3％组着色浅，说明高脂高胆固醇组AS斑块病变严重。高脂高胆固醇组AS斑块部位石蜡切片，HE染色后，光镜下可见纤维斑块，并有玻璃样变，深部有钙化、红染无结构不定性坏死组织，有散在的泡沫细胞存在，斑块底部弹力膜大部分被破坏。另外，肉眼观察可见对照组小型猪的肝脏的脂质沉积明显少于高脂高胆固醇组。3.0％胆固醇组较饲养1.5％胆固醇组病变明显。

(二)肝X受体的表达情况

1.材料和方法

(1)组织样  饲养12个月后的实验猪全部杀死，取其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脂肪组织放-80℃保存，以提取各组织RNA分析与胆固醇代谢相关两个基因LXRa和LXRb的组织表达差异。

(2)LXRa和LXRb基因CDS的克隆  先以人LXRa和LXRb基因的cDNA序列为信息探针，利用 NCBI中的BLAST工具在GeneBank的猪EST数据库中搜索同源序列，获得一系列同源性为80％以上的 ESTs(片段长度大于100bp)，下载这些高度同源的ESTs，然后用DNAstar中的SeqMAN程序构建猪EST-重叠群。以拼接序列为基础利用软件Primer Premier5.0设计用于扩增完整编码区(coding sequence， CDS)的引物KaF和KaR及KbF和KbR。表2-24中的引物由上海英俊技术有限公司设计。

PCR扩增反应体系为10μL，反应条件：95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环。电泳检测PCR产物，回收目的片段并测序。

(3)ImpRH定位  将所克隆到的猪LXRa和LXRb基因cDNA与人的该基因全长cDNA在NCBI(National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比对，大致了解该基因各外显子的拼接位点。根据所得信息，在第1和第2个外显子上设计引物(DaF和DaR)用于分离第1内含子序列。分别在小鼠和猪的基因组中进行扩增，并设空白阴性对照。当猪基因组DNA中扩增得到特异目的片段，而小鼠基因组扩增结果为阴性时，则以猪×仓鼠体细胞辐射杂种板DNA为模板作PCR扩增分型。

PCR扩增反应体系为10μL，条件：95℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测分型。将PCR分型数据提交给IMpRH统计分析网站(http:// www.toulouse.infra.fr/)进行统计分析以获得IMpRH克隆板的定位结果。

(4)猪LXRa和LXRb基因的组织表达谱分析  用TRIZOL提取RNA，然后分别取各组织的总 RNA 1μg反转录，体积为50μL，其中引物dT11 1μmol/L，M-MLV反转录酶300U，dNTP500μmol/L。于42℃温育1h后，95℃5min灭活反转录酶。cDNA置－20℃备用。以GAPDH作内参基因，用半定量RT-PCR方法检测PANE1基因在这些组织中的表达水平。

PCR扩增反应体系为10μL，条件：95℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测分型。

2.结果分析

(1)cDNA序列分析  LXRa和LXRb基因通过测序分别获得长1244bp和1065bp的cDNA片段，应用GenTool软件的ORF分析程序进行分析，发现LXRa基因序列包含543bp的最大开放阅读框(ORF，open reading frame)，编码180个氨基酸。其起始密码子是ATG，终止密码子是TGA。两翼有486bp的5'非翻译区和215bp的3'非翻译区。LXRa基因序列包含678bp的最大开放阅读框，编码216个氨基酸。其起始密码子是ATG，终止密码子是TGA。两翼有258bp的5'非翻译区和129bp的3'非翻译区。

(2)染色体定位  结果分析表明，LXRa基因位于猪2号染色体上，与SWR1445位点和SW2513位点紧密连锁，LOD值分别为8.65和6.28。ACO2位点对应于人的11号染色体上的p11-12区域，而人LXRa基因在人的染色体上11p11.2的研究结果相符，说明定位结果可靠。

LXRb基因位于猪6号染色体上，与S0333位点和S0300位点紧密连锁，LOD值分别为9.86和7.73。LXRb位点对应于人的19号染色体上的q13-14区域，而人LXRb基因在人的染色体上19q13.3的研究结果相符，说明定位结果可靠。

引物以118个猪×仓鼠体细胞辐射杂种板DNA为模板的扩增结果(表2-25)。“1”表示扩增得到目的片段，“0”表示没有扩增到目的片段。

(3)组织表达  在3％组成年小型猪的心、肝、脾、肺、肾、脂肪组织及主动脉等组织样中检测该基因的表达情况，结果显示LXRa和LXRb基因在所检测的7个组织样中均有表达，但在肝脏、主动脉和脂肪组织中表达相对丰富(图2-2)。

(三)讨论

现代医学的动物模型复制是在已知的致病因素理论上重复或模拟病因，以造成对实验动物的影响和刺激，而动物模型的建立不仅反映在动物对致病因素所反映出的外观表现，更重要的是动物具有特定的客观病理改变，并可以此为模型成立与否的依据。而中医(或中西医结合)的实验动物模型的研究应用则有所不同，一方面要以中医理论为依据而复制出具有中医证候诊断特征的动物模型，以实验动物所反映出的外在表现为诊断依据。很多证型能从实验动物外在表现的观察中得到数据，还需要应用现代科学技术，用微观的、量化的客观标准来表示证候，这就是中医药现代化的作法。

目前关于痰证尚无统一的诊断标准。建立痰证的诊断标准，是中医规范化的需要。这是关系到痰证研究正确与否的重要前提。选择合适的研究指标，尤其是寻找具有痰证特异性的指标，是揭示痰证本质和发展中医的必要手段。

众所周知，复杂高胆固醇血症与AS的发生有密切的关系，血浆胆固醇以脂蛋白形式存在，其中60％～70％存在于低密度脂蛋白(LDL)中，AS斑块中大量聚集的脂质成分主要是LDL带的AS模型表现血脂升高，大动脉及冠状动脉皮下脂质浸润，大面积粥样斑块形成。另外，血管内皮细胞损伤被认为是产生动脉粥样硬化的始动环节，损伤不仅包括形态学上可见的变化，还有功能及代谢改变，继发于内皮损伤的内皮通透性、黏附性、血液凝固改变等可导致血管壁产生的一系列连锁反应，从而引起血液内脂质沉积，而逐渐形成粥样斑块。

本实验以高脂高胆固醇饲料喂饲小型猪复制出动脉粥样硬化痰证动物模型。实验结果显示，实验组小型猪较正常组小型猪的血浆总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白含量明显升高，高密度脂蛋白含量明显减少。主动脉可见脂质条纹、稳定性斑块和不稳定性斑块，肝脏有明显脂质沉积。这些结果说明，复制动脉粥样硬化痰证小型猪动物模型成功。实验组的饲养3％胆固醇组较饲养1.5％胆固醇组病变明显，血浆总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白含量明显升高，高密度脂蛋白含量明显减少。但LXRa和LXRb基因在这两组小型猪的组织表达中无明显差异。

近来在多种核内因子如肝X受体(LXR)大量研究已经取得了一定成果。它可以调节包括ABCA1在内的多种与脂类代谢有关的基因的表达，从而调节机体的脂类代谢平衡。

LXR对胆固醇的合成、食物中胆固醇的吸收以及胆固醇逆向运输通路(Reverse cholesterol transport，RCT)中的一些运输蛋白和关键酶的表达有调节功能，从而调节血中脂含量，达到抑制动脉粥样硬化的形成。

LXR通过调节ATP结合盒转运子A1(ABCA1)、ATP结合盒转运子A1(ABCG1)、载脂蛋白E(ApoE)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、磷脂转运蛋白(PLTP)、胆固醇酯转运蛋白(CETP)、ATP结合盒转运子G5(ABCG5)等转运蛋白和酶来从每一步调节胆固醇流出全过程，从而在整体水平调节脂代谢。

在本次实验研究中，我们可以看到实验组的动脉粥样硬化小型猪的肝组织和主动脉组织LXR的表达增高，这可能有利于提高肝脏以及可利用胆固醇的器官在高脂的条件下摄取脂质的能力，促进脂质的吸收利用，减少其在血液中的蓄积。LXR在血管的表达上调则可以增加血管内皮细胞脂质的流出，减少细胞内脂质的蓄积，从而延缓动脉粥样硬化的发生。这些结果提示，对肝X受体进行有效调控有可能防止动脉粥样硬化的发生、在肝脏或动脉提高LXR的表达和/或活性，可以加速胆同醇从高浓度区，转变为低浓度区，乃至降为正常水平，因此，有可能成为抗动脉粥样硬化新的治疗方案。

基于上述实验基础，我们可以通过调节LXR来调节一组在脂类代谢中起重要作用的蛋白，一方面促进脂类代谢，一方面抑制天然免疫应答，从这两方面来阻碍动脉粥样化。但需要注意的是，LXR的靶基因并非都是阻碍动脉粥样化的形成，且实验中与活体中LXR的表达、活性有差异。因此，还需要大量的临床试验来进一步研究。但LXR功能的明确无疑为人类预防、治疗动脉粥样硬化又铺设了一条新道路。

到目前为止，有不少的专家用鼠、兔、猪、狗、猴等实验动物制造了大量的动脉粥样硬化的疾病模型，对我们进一步深入研究动脉粥样硬化提供了许多新的实验和诊疗依据。鼠、兔、狗、猴等实验动物由于各种原因都不算是理想的动脉粥样硬化痰证的首选实验动物。

小型猪在解剖学、生理学、营养代谢等方面与人类极为相似，疾病的发生发展和转归等方面更接近于人类。通过近交选育后的小型猪品种纯、遗传背景清楚，对实验耐受性强、反应均衡、实验重复性高，因此在生物医学领域中得到广泛应用。