科普知识
小鼠基础知识八:Tamoxifen诱导型cre
Cre-lox系统虽然能有效帮助我们在特定的组织中进行基因敲除,但Cre重组酶表达的时间是由其启动子决定的。如果你希望在特定时间段人为操纵Cre重组酶的活性,比如说要研究某个基因在小鼠发育特定时期的功能,应该怎么办呢?今天J博士将介绍一种时空特异性敲除系统:Tamoxifen诱导型CreER重组酶。
01 什么是CreER重组酶
为了给Cre-Lox系统的加上可诱导的属性,研究者开发了配体依赖的CreER重组酶。
它由cre重组酶与雌激素受体(estrogen receptor, ER)的激素结合域相融合组成。在没有雌激素类似物Tamoxifen的作用下,CreER重组酶停留在细胞质中,无法发挥功能;只有在与雌激素结合的条件下,CreER才可以进入细胞核中驱动LoxP位点发生重组。目前为止,CreER系统已经改进成雌激素结合域携带G400V/M543A/L544A三位点突变的CreERT2重组酶系统,其在无诱导物的情况下降低了本底活性,并同时提高了Tamoxifen的敏感性和效率。
02 Tamoxifen的配制和使用剂量
如何配制和使用Tamoxifen,是CreER系统开展实验中不可避免会遇到的问题。针对这一点,J博士总结了一些常用的方法供大家参考。
需要注意的是,不同的实验设计、不同的小鼠品系以及不同的分析方法对于前期实验的要求往往有所差异,包括给药剂量、给药频率和方式等。因此,下述方法只是一个参考,在实验过程中往往还应根据参考文献、实验经验设计预实验,以确定最佳方案。
▲ Tamoxifen的配制
将Tamoxifen溶解在玉米油中,终浓度为20 mg/ml,并在37 ℃下摇晃过夜。需注意Tamoxifen对光敏感,在制备和储存过程中需要避光处理。Tamoxifen溶解后可短暂保存于4 ℃,长期保存需存放在-20 ℃。
▲ Tamoxifen使用剂量
Tamoxifen可以通过腹腔注射、灌胃、饮食/饮水等方式进行给药,不同的方法所需要注意的点不尽相同。
① 腹腔注射给药
● 优:剂量精准
● 缺:对小鼠压力大,需要熟练操作
成年鼠诱导时需按体重确定注射剂量,约75 mg/kg小鼠体重。每24小时注射一次,连续2~5天,在最后一次注射结束后7天便可开展后续实验。
● 对于需要胚胎期诱导的小鼠,可以对孕鼠按上述剂量进行1~2天Tamoxifen腹腔注射。但是需注意Tamoxifen会影响胎儿发育和生产,诱导的时间尽量选择孕晚期,并同时注射孕酮来减少流产概率。
● 除以上建议的剂量以外,J博士还整理了部分文献中对孕鼠和新生小鼠给药方式[1],供大家参考使用:
② 灌胃给药
● 优:较饮食/饮水而言剂量准确,较腹腔注射而言对小鼠压力小
● 缺:操作耗费时间,同样需要熟练操作
● 同样需要按体重给药,约75 mg/kg小鼠体重,每24小时灌胃一次,连续5天。
③ 饮食/饮水给药
● 优:对小鼠造成压力最小
● 缺:易受小鼠饮食习惯影响,且在水中溶解度低,诱导时间需较长
● 与腹腔注射和灌胃相比,饮食/饮水需要长达几周的诱导时间,在此期间体重也可能会比正常水平下降10%~15%。
注意事项
● Tamoxifen不溶于水,需溶于酒精和玉米油中。
● 对照组小鼠需要同步进行不含Tamoxifen的玉米油溶液给药。
● Tamoxifen处理组和未处理小鼠应该分笼饲养,舐舔Tamoxifen悬浮液、梳毛或吞食行为可能会导致Tamoxifen意外摄入并诱导敲除。