在上一讲中，J博士介绍了依赖tamoxifen诱导型CreER重组酶系统，它能够帮助我们实现空间与时间双重特异性调控基因的目的。

内容回顾：小鼠基础知识八｜J博士进阶教学，Tamoxifen诱导型cre 

今天，J博士带领大家学习另外一种可逆的四环素诱导型Cre-lox系统，又可被称为Tet on/off系统。

本篇内容重点：

● 什么是Tet on/off 系统

● 小鼠中如何应用Tet on/off系统

● Tet on/off诱导系统优点和常用品系

● Dox给药方式

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01什么是Tet on/off系统

四环素（Tetracycline,Tet）诱导系统是由E.coli大肠杆菌中Tn10转座子改造而来，可依赖四环素进行可逆地调控基因表达。

如下图所示，该系统在大肠杆菌中由四环素阻遏蛋白（Tet repressor, TetR）和Tet操纵子（Tet operator, TetO）组成。

● 在缺乏四环素(Tc)或其衍生物强力霉素（dox）的情况下，TetR二聚体与TetO结合，阻断基因表达（左图）。

● 当Tc或dox与TetR结合时，诱导TetR构象变化，导致其与TetO分离并促进基因表达（右图）。

四环素调控系统原理^[1]

利用TetR阻遏蛋白和TetO DNA元件可以在依赖Dox作用下进行可逆结合的原理，研究者开发出适用于真核生物的调控系统。将TetR与单纯疱疹病毒（HSV）VP16蛋白转录激活区域融合使其起到增强子的功能。并将TetO改造为弱启动子，只有与TetR增强子相结合才可调控下游基因表达的正常表达。 

如下图所示：TetR被改造为存在Dox的情况下，分别起到结合或不接合TetO两种效果，即Tet on/off系统。

● Tet on系统中，tetR被改为rtTA，在Dox存在条件下，可以与tetO结合开启下游基因表达，因此为Tet on系统；

● Tet off系统中，tetR被改造为tTA，其与Dox结合后从TetO元件上解离下来，关闭基因表达，因此为Tet off系统。 

02 小鼠中如何应用Tet on/off系统

以Tet on为例，在小鼠中通常将rtTA元件和tetO元件分别构建在不同的小鼠品系当中，而rtTA可以在不同的启动子下驱动，以达到特异性组织诱导的功能。两个小鼠品系配繁的后代，即可通过Dox给药或去药，达到在特异组织中可逆调控基因表达的目的。

此外，Tet on/off系统还可以与cre-lox系统联合使用，利用强大的cre工具小鼠库，不需要重新构建rtTA/tTA小鼠即可实现在广泛的组织中进行可逆调控基因表达。 

比如：我们先利用Pdx1-cre小鼠和带有LSL元件的rtTA floxed小鼠配繁，使其后代在胰腺表达rtTA蛋白。再将这个小鼠与携带tetO元件的Kras*G12D小鼠配繁，其后代小鼠就可以在Dox诱导下调控Kras*G12D蛋白的表达了。 

03 Tet on/off诱导系统优点和常见品系

● 精准性：药物剂量及诱导时间可控，无内源干扰

● 可逆性：去除Dox后系统即关闭，并可反复多次诱导

● 灵敏性：低剂量，即可获得高效率结果

● 便捷性：使用食物或饮水给药，即可取得良好效果 

04  Dox给药方式

● 饮水 ：用水制成100倍的Dox 20 mg/mL的储备溶液。在小鼠设施中，配置成最终浓度为200微克/毫升的溶液。最好使用琥珀色的水瓶，因为Dox对光敏感。

● 饮食：食物中的Dox可由饲料公司进行定制，每kg饲料中加入200 mg Dox。在食物中可以添加食用色素，有助于追踪哪些小鼠在服用DOX。

● 腹腔注射：10 mg Dox在0.5mL水中可以作为一次IP注射，仅针对病重的小鼠(如无法自主饮食的小鼠)。

需要注意的是，不同基因工程小鼠对于Dox的响应是有区别的，最好还是参考所关心的小鼠品系的相关文献，并且在开展自己的实验前，根据实验目的进行条件摸索。 

参考文献：

[1] van Til NP, Markusic DM, van der Rijt R, Kunne C, Hiralall JK, Vreeling H, Frederiks WM, Oude-Elferink RP, Seppen J. Kupffer cells and not liver sinusoidal endothelial cells prevent lentiviral transduction of hepatocytes. Mol Ther. 2005 Jan;11(1):26-34.