(1)造模方法:实验组给大鼠腹股沟皮下注射醋酸可的松每只25mg,每周两次,同时饮水中加入四环素1g/L,以预防细菌性感染。6~12周后陆续剖杀大鼠。无菌分离并部分横断切开气管,插入连接有5ml注射器(内装生理盐水)、粗细适宜的塑料导管,并加以固定。通过注射器行支气管肺泡灌洗(brochial aloveolar lavage fluids, BALs),连续7~8次,回收30~40ml的支气管肺泡灌洗液。2000转/分离心10min,弃去上清液,取少量沉淀涂片。生理盐水洗净肺表面血液,切开肺各叶,制成肺组织印片,BALs沉淀、肺组织冻存在-20℃。
病原检测方法:肺组织印片和肺内灌洗液涂片先经甲醇固定2min,然后分别使用三种染色方法鉴定病原。姬姆萨染色:用pH 6.8~7.2磷酸盐缓冲液(PBS)按1:20稀释姬姆萨原液制成染液,染色2h,油镜下观察。瑞-姬姆萨染色:将瑞-姬姆萨染色液(1.0g瑞氏染料和0.5g姬姆萨染料深于500mL甲醇配制而成)直接滴加在印片或涂片上,进行染色5~10min,油镜下观察。亚甲胺兰染色:将0.1%亚甲胺兰染色滴加在印片或涂片上,进行染色5~20min,油镜下观察。
(2)结果:大鼠用药第2周后,体重不升或开始下降。至第6周体重减少约32%。动物活动及摄食减少,萎靡、消瘦、出现斑片状毛、呼吸急促,最后多因呼吸极度困难而死亡。
实验大鼠的肺印片肺孢子菌病原学染色检查阳性率为96%(24/25),BALs沉淀涂片阳性率为44%。诱导实验包囊检出时间最早的为用药40天,且随用药时间的延长,感染程度逐渐加重。对照组均未检出阳性。