在该研究中，作者首先从生物过程、调控网络、异常代谢途径、异常信号传导途径和免疫相关途径等方面对ESPL以及ESCC进行了分析（图1 a, b）。研究发现成纤维细胞和M2巨噬细胞及调节T细胞（Treg）在LGIN和HGIN阶段丰度增加，M1巨噬细胞减少（图2 c-g），表明ESPL阶段处于免疫抑制状态，这可能会引起抗肿瘤免疫应答减弱，从而促进ESCC的肿瘤发生。主成分和差异表达基因（DEGs）分析以及各阶段信号转导通路变化显示，类癌样改变主要始于HGIN阶段，提示患有高ESCC风险的LGIN患者应尽早治疗。 

图1 ESPL状态分析^[1] 

研究中发现一些DEGs在正常食管上皮细胞到ESCC的疾病进展过程中呈现逐步增加或减少的趋势，这类基因很可能参与了ESCC的发展进程。该研究团队采用机器学习方法筛选出潜在的与ESCC进展相关的候选基因，包括TAGLN2，CRNN，KRT16，KRT17和MAL（图2 a-d）。免疫组化染色（IHC）检测结果显示TAGLN2和KRT16的蛋白水平在ESCC的进展过程中显著增加，而CRNN的蛋白表达水平则降低（图3 e），KRT17和MAL表达在各阶段均无显著性差异。另外，该团队对同一病人由LGIN进展成HGIN及HGIN进展成ESCC前后配对的组织样本进行分析，结果显示与进展前的样本相比，进展后的组织样本中TAGLN2蛋白水平显著增加，而CRNN的表达减少（图3 a-d），KRT16在进展前后无显著差异，进一步证实了TAGLN2和CRNN与ESCC进展的相关性。因此，作者选择TAGLN2和CRNN开展下一步研究。 

图2 用于ESPL诊断和预测ESCC风险的潜在指标筛选^[1] 

图3 验证候选基因与ESCC进展的相关性^[1] 

该团队通过细胞增殖、克隆形成、类器官和人源性组织异种移植（PDX）等体内外实验分析了候选基因在ESCC进展中的作用机制。在体内研究中，研究人员构建了食管鳞癌PDX模型（其中CB17-SCID雌性免疫缺陷小鼠由赛业生物提供），在小鼠皮下接种瘤块后，每周两次瘤内注射相应的慢病毒，观察基因敲低或过表达对肿瘤生长的影响。结果表明，敲低TAGLN2或过表达CRNN会抑制食管鳞癌细胞系、类器官和PDX肿瘤的生长（图4）。在对正常食管上皮细胞的研究中发现，TAGLN2促进了正常细胞向恶性细胞的转化，而CRNN抑制了这种转化。 

图4 候选基因在ESCC进展中的作用^[1] 

总的来说，TAGLN2通过调控细胞增殖促进ESCC的进展，而CRNN则通过对细胞增殖的调控抑制ESCC的进展。TAGLN2和CRNN有望作为ESPL向ESCC进展的潜在风险指标，有助于ESCC的预防和早期干预。该研究表明应该对食管癌前病变TAGLN2和CRNN异常表达的高危人群进行早期干预，为食管癌的精准预防提供了新思路。