杨硕/王曦/陈芸等合作发现调控CD8+ T细胞记忆形成新机制
CD8+记忆T细胞在机体抵御感染和癌症中发挥着至关重要的作用，能够建立强烈且快速的二次应答反应。目现已发现一系列转录因子可以促进CD8+记忆T细胞分化，包括TCF-1、BCL6、ID3和MYB等。其中以TCF-1为中心的转录调控网络在CD8+记忆T细胞的产生中发挥关键核心作用。然而，影响TCF-1表达和活性的上游关键调控机制以及这些调控对CD8+记忆T细胞形成和功能发挥的影响仍然未知。
2024年1月，南京医科大学杨硕教授联合王曦和陈芸教授以及美国马萨诸塞大学医学院Fiachra Humphries教授合作在Nature cell biology发表题为ECSIT facilitates memory CD8+ T cell development by mediating fumarate synthesis during viral infection and tumorigenesis的研究论文。该研究揭示了ECSIT蛋白可作为记忆T细胞分化关键转录因子TCF-1上游重要调控蛋白，在调控CD8+记忆T细胞形成和促进机体持续免疫反应力中发挥重要作用。
南京医科大学基础医学院已毕业博士（现工作于无锡市儿童医院检验科）杨勇兵和基础医学院博士研究生王亚男为本文的共同第一作者，南京医科大学基础医学院杨硕教授、生殖医学与子代健康全国重点实验室王曦教授、药学院陈芸教授和美国马萨诸塞大学医学院Fiachra Humphries教授为本文的共同通讯作者。
图片来源：《Nature cell biology》
研究材料与方法 在这项研究中，研究人员采用Ecsit-EGFP报告基因小鼠（赛业生物提供）研究ECSIT在不同免疫细胞和不同状态的CD8+ T细胞的表达 。
研究方法 流式细胞术、RNA-seq、ATAC-Seq、ChIP-seq/qPCR、Western blotting、免疫荧光染色、Seahorse、代谢组学。
技术路线 01 ECSIT在CD8+记忆T细胞中高表达 02 病原刺激下，ECSIT促进CD8+记忆T细胞分化和功能 03 ECSIT促进TCF-1表达及转录调控进而促进CD8＋记忆T细胞分化和功能 04 ECSIT缺失抑制富马酸产生，促进KDM5活性进而抑制Tcf7的H3K4me3修饰
研究结果 1 ECSIT在CD8+记忆T细胞中高表达 作者通过分析公开数据库发现在稳态、感染或者黑色素瘤小鼠中，ECSIT都在CD8+记忆T细胞中高表达。随后作者通过构建Ecsit-EGFP小鼠（赛业生物提供）对此结果进行验证，结果与数据库分析一致。 ECSIT在CD8+记忆T细胞中高表达[1] 2 ECSIT缺失抑制急性病毒感染下CD8+记忆T细胞分化 为了研究ECSIT对CD8+记忆T细胞形成的作用，并排除ECSIT在应答早期对CD8+效应T细胞的影响，作者构建了ECSIT的Ecsitfl/fl Rosa26CreERT2 OT-1诱导型敲除小鼠。随后将小鼠脾脏中的naïveCD8+T细胞以相同的数目分别静脉注射到野生型受体鼠中，1天后对受体鼠注射VSV-OVA病毒感染。在感染后第21-25天对受体鼠腹腔注射他莫昔芬诱导ECSIT敲除，感染35天后检测受体鼠OT-1记忆T细胞的变化。结果显示CD8+记忆T细胞及记忆前体细胞的比例及数目在ECSIT缺失后显著下降，并且促进记忆T细胞形成的转录因子的表达同样降低。 ECSIT缺失抑制急性病毒感染下CD8+记忆T细胞分化[1] 3 测序结果表明ECSIT缺失抑制CD8+记忆T细胞分化和Tcf7的转录调控 为了探究ECSIT影响CD8+记忆T细胞分化和功能的具体机制，作者将感染后35天的CD45.1受体鼠中的WT和iKO中的OT-1细胞分选出来进行RNA和ATAC测序。分析显示ECSIT缺失后CD8+T细胞中记忆分化相关的基因表达及信号通路均显著降低。联合分析发现，TCF-1是ECSIT影响CD8+记忆T细胞分化最显著的转录因子。 测序结果表明ECSIT缺失抑制CD8+记忆T细胞分化和Tcf7的转录调控[1] 4 急性病原体刺激下，ECSIT缺失通过抑制富马酸产生来促进KDM5酶活性，进而抑制TCF-1表达 测序发现ECSIT缺失显著影响代谢相关通路，因此作者将体外诱导分化的记忆T细胞进行LC-MS代谢组学分析。结果显示富马酸是ECSIT缺失后下降最为明显的代谢物。鉴于富马酸可以抑制组蛋白去甲基化酶KDM5酶活性，以及记忆T细胞TCF-1的启动子区域存在大量H3K4me3修饰位点，作者推测ECSIT是通过影响富马酸产生来抑制KDM5酶活性，从而促进TCF-1启动子区域H3K4me3修饰，促进TCF-1表达调控，最终影响CD8+记忆T细胞分化。 ECSIT缺失通过抑制富马酸产生来促进KDM5酶活性，进而抑制TCF-1表达[1] 5 ECSIT缺失促进肿瘤进展和CD8+ T细胞耗竭 接下来作者想探究ECSIT是否也能影响肿瘤中CD8+记忆T细胞的形成。因此作者对受体鼠进行B16-OVA皮下荷瘤，第二日将小鼠脾脏中的naïve CD8+T细胞富集出来，1：1静脉注射到受体小鼠体内。第10-15天对受体鼠腹腔注射他莫昔芬诱导Ecsit敲除，之后检测肿瘤生长和小鼠存活，及肿瘤微环境中OT-1细胞的变化。结果显示ECSIT缺失显著促进了肿瘤生长，抑制肿瘤小鼠存活，同时肿瘤内CD8+耗竭T细胞显著增加，而干细胞样耗竭前体细胞显著减少。 ECSIT缺失促进肿瘤进展和CD8+ T细胞耗竭[1] 6 ECSIT缺失抑制肿瘤慢性刺激下CD8+干细胞样耗竭前体细胞基因表达和TCF-1转录调控 为探究ECSIT影响肿瘤微环境中CD8+干细胞样耗竭前体T细胞分化和功能的具体机制，作者将移植20天的CD45.1受体鼠中的OT-1细胞分选出来进行RNA和ATAC测序。结果显示ECSIT缺失后，干细胞样耗竭前体T细胞分化相关的基因表达及信号通路均显著降低。联合分析发现，TCF-1是ECSIT影响CD8+干细胞样耗竭前体T细胞分化最显著的转录因子。 ECSIT缺失抑制CD8+干细胞样耗竭前体细胞基因表达和TCF-1转录调控[1] 7 慢性刺激下，ECSIT缺失通过抑制富马酸产生来促进KDM5酶活性，进而下调TCF-1表达 作者将体外慢性抗原刺激的OT-1细胞进行LC-MS代谢组学分析。结果表明富马酸同样是ECSIT缺失后下降最为明显的代谢物。KDM5酶活性测试、H3K4me3 ChIP-seq和富马酸二甲酯（DMF）体内外回补实验验证了ECSIT通过影响富马酸产生来抑制KDM5酶活性，从而促进TCF-1启动子区域H3K4me3修饰，促进TCF-1表达调控，最终影响CD8+记忆T细胞分化的猜想。 ECSIT缺失通过抑制富马酸产生来促进KDM5酶活性，进而下调TCF-1表达[1] 研究结论 综上，该研究首次发现影响CD8+记忆T细胞分化核心转录因子TCF-1代谢表观调控机制，同时发现进化保守蛋白ECSIT在适应性免疫CD8+记忆T细胞中的重要功能，揭示了富马酸在抗肿瘤免疫联合治疗中的潜在应用价值。 
原文检索： [1]Yang Y, Wang Y, Wang Z, Yan H, Gong Y, Hu Y, Jiang Y, Wen S, Xu F, Wang B, Humphries F, Chen Y, Wang X, Yang S. ECSIT facilitates memory CD8+ T cell development by mediating fumarate synthesis during viral infection and tumorigenesis. Nat Cell Biol. 2024 Feb 7. doi: 10.1038/s41556-024-01351-9.
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