Impact factor: 11.5（2023）

Published online：2023-06-01 

研究背景 

紧密连接蛋白（Claudins）是一类存在于上皮和内皮紧密连接中的整合素膜蛋白，其表达异常可引起系统感染性疾病乃至肿瘤等多种疾病的发生。目前，CLND 18.2抗体VYLOY（zolbetuximab）药物已上市，用于治疗CLDN18.2阳性、不可切除、晚期或复发性胃癌患者。

Claudins家族成员CLDN6在在多种人类癌症中表达，包括卵巢癌和子宫内膜癌，而在正常成年组织中几乎检测不到，这种表达模式使得CLDN6成为开发潜在治疗性抗体-药物偶联物（Antibody-drug conjugate，ADC)的理想靶点，其有望作为继CLND 18.2之后的下一个实体肿瘤治疗靶点。本研究制备了特异性抗CLDN6的人源化单抗及抗体-药物偶联物，通过人源肿瘤细胞系异种移植（Cell derived xenograft, CDX）模型和患者来源的异种移植（Patient-derived xenograft，PDX）模型探究了其疗效。

目前，针对晚期癌症患者（包括卵巢癌、子宫内膜癌和晚期实体肿瘤）的首次人体试验（NCT05103683）正在进行中，以评估CLDN6-23-ADC的安全性、耐受性、药代动力学和抗肿瘤活性。 

研究结果

1.人源化抗CLDN6蛋白特异性抗体的制备和鉴定 

使用CLDN6特定区域的肽段（CLDN6蛋白的138-160氨基酸）免疫小鼠，筛选出与CLDN6蛋白特异性结合的杂交瘤细胞，并进行亚克隆、测序，将具有抗肿瘤活性的单抗进行人源化。

研究发现抗体#23（CLDN6–23-mAb）具有以下优点：与多种CLDN6+细胞系的细胞膜上CLDN6蛋白结合能力最佳（图A）；在温度和冻融应力测试期间及之后的聚集或降解水平低；特异性结合CLDN家族中的CLDN6蛋白；对CLDN6过表达的细胞有较高的结合作用（图B）。 

研究者使用多种CDX模型评估CLDN6-23-mAb的治疗潜力和特异性。CLDN6-23-mAb治疗后，膀胱癌UMUC4 (CLDN6+，高表达)、小细胞肺癌H841 (CLDN6 +，高表达)小鼠的肿瘤生长抑制情况显著（图A、B）；卵巢OV90 (CLDN6+，中表达)小鼠的肿瘤生长抑制情况不显著（图C）；黑色素瘤M202（CLDN6-）小鼠的肿瘤无生长抑制情况（图D）。研究过程中小鼠对CLDN6-23-mAb的耐受性良好。 

使用抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）体外报告基因检测体系，证实CLDN6-23-mAb可以在ARK2细胞（CLDN6+）中诱导ADCC，但不能在M202细胞（CLDN6-）中诱导ADCC（图E）。研究者使用NSG小鼠（T、B、NK细胞缺陷）建立了UMUC4 CDX模型，并进行CLDN6–23-mAb治疗，发现其对NSG小鼠中的肿瘤生长无显著抑制作用（图F），这表明诱导ADCC是CLDN6–23-mAb产生肿瘤细胞生长抑制的重要组成机制。 

通过荧光显微镜分析，CLDN6-23-mAb在CLDN6+癌细胞中迅速内化了CLDN6/CLDN6–23-mAb复合物(图3G)。内化的CLDN6与溶酶体相关膜蛋白1 (LAMP1)共定位，表明CLDN6与CLDN6-23-mAb在细胞内共同运输到溶酶体，这为CLDN6 ADC药物进入细胞内部提供了可能性。 

2.抗CLDN6 ADC、CLDN6-23-ADC的体外鉴定 

通过连接子VC-PAB将单甲基Auristatin E(MMAE)与抗CLDN6抗体偶联得到CLDN6-23-ADC，偶联过程不对抗原识别产生影响。CLDN6-23-ADC处理细胞后，在ARK2和OVCA429肿瘤细胞系中观察到了CLDN6+与LAMP1的共定位(图B)，抗体内化速率与CLDN6-23-mAb相似。 

在OVCA-429细胞（CLDN6+）中观察到CLDN6-23-ADC的剂量依赖性体外抗增殖反应(图C），对M202（CLDN6-）细胞的影响较小。CLDN6-23-ADC处理OVCA-429细胞48小时后，可观察到剂量依赖性诱导肿瘤细胞凋亡，对M202细胞的影响较小。 

3.CLDN6-23-ADC在多种CLDN6+ CDX模型中具有显著的抗肿瘤活性 

研究者使用UMUC4（CLDN6+）CDX模型评估CLDN6-23-ADC/CLDN6–23-mAb的体内疗效（1次/周，3周）。结果显示，与IgG对照组相比，CLDN6-23-mAb、CLDN6-23-ADC实验组小鼠肿瘤体积减小（图D）。通过分析肿瘤样本中活细胞的数量，发现CLDN6-23-mAb、CLDN6-23-ADC实验组活细胞明显减少(图E)。在治疗第11天，IgG对照组和CLDN6-23-mAb组肿瘤分别含有78%和72%的活肿瘤细胞，而CLDN6-23-ADC组活肿瘤细胞小于1%。 

4.CLDN6-23-ADC可持续抑制CLDN6+ CDX和 PDX模型荷瘤小鼠肿瘤生长 

研究者进一步使用UMUC4、ARK2、OV90细胞系CDX模型评估CLDN6-23-ADC的疗效（1次/周，3周），IgG对照组因小鼠高肿瘤负荷而安乐死，并终止肿瘤测量。在CLDN6-23-ADC治疗后，UMUC4、ARK2和OV90 CDX模型的小鼠肿瘤体积显著下降(图A-C)。 

研究者进一步利用NGS小鼠卵巢癌PDX模型评估CLDN6-23-ADC的疗效，选择CLDN6+(DF149和DF181)和CLDN6-(DF20)三个PDX模型进行实验（图D)。 

结果显示，CLDN6-23-ADC治疗导致CLDN6+ PDX模型中肿瘤体积显著减小(图E)，小鼠生存率100%；CLDN6- PDX模型中肿瘤体积仅在开始治疗时体积减小，随后肿瘤体积增加，几乎所有小鼠在肿瘤进展中死亡。

 结论

本研究发现，CLDN6-23-mAb可以特异性结合CLDN6，并产生抗体内化作用，可使CLDN6+ CDX模型荷瘤小鼠肿瘤体积显著减小。

相比CLDN6-23-mAb，CLDN6-23-ADC抑制CLDN6+肿瘤效果更显著，肿瘤活细胞不足1%，实验小鼠生存率可达到100%，有望作为治疗CLDN6+实体肿瘤的有效药物，目前已进入首次人体实验。 

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公司简介：

南昌乐悠生物科技有限公司是一家专业从事肿瘤动物模型构建及抗癌新药临床前药效评价的国家高新技术企业，已经为包括小分子靶向药、大分子靶向药（包括ADC）、溶瘤病毒、细胞药物（TIL、γδT）等多种抗癌新药研发提供了有力的支持，其中部分药物已经进入临床试验申请(IND)阶段。

REFERENCE：McDermott MSJ, O'Brien NA, Hoffstrom B, Gong K, Lu M, Zhang J, Luo T, Liang M, Jia W, Hong JJ, Chau K, Davenport S, Xie B, Press MF, Panayiotou R, Handly-Santana A, Brugge JS, Presta L, Glaspy J, Slamon DJ. Preclinical Efficacy of the Antibody-Drug Conjugate CLDN6-23-ADC for the Treatment of CLDN6-Positive Solid Tumors. Clin Cancer Res. 2023 Jun 1;29(11):2131-2143. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-22-2981. PMID: 36884217; PMCID: PMC10233360.