Impact factor: 64.8（2023）

Published online：2024-04-10

研究背景

嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor， CAR）是一种基因工程技术制造的人工受体分子，它可以赋予免疫效应细胞（T细胞）针对某个靶点抗原表位的特异性，从而增强T淋巴细胞识别抗原信号与活化的功能。CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤（如急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤）有良好疗效，由于实体肿瘤微环境中的免疫抑制作用，导致T细胞持久性差和代谢功能失调，使CAR-T细胞在实体肿瘤中的疗效受限。

FOX家族分子作为转录因子可以通过调控靶基因，参与多种细胞生物学过程，在癌症发生发展中发挥重要作用，其中FOXO1主要参与细胞凋亡、应激、DNA损伤/修复、肿瘤发生、血管生成和糖代谢等生命过程。

本研究通过在小鼠靶向HER2(受体酪氨酸激酶)的CAR-T细胞中过表达转录因子FOXO1- ada（FOXO1的组成型活性变体）或在人靶向Lewis Y的CAR - T细胞中过表达野生型FOXO1，探究过表达FOXO1的CAR-T细胞对实体肿瘤的治疗作用。 

研究结果

1.LI-15刺激CAR-T细胞表达FOXO1

研究者使用含IL-15培养基（用于调节实体肿瘤治疗的免疫微环境失调）培养靶向HER2的小鼠CAR-T细胞，用于治疗E0771 （ 小鼠髓样乳腺癌细胞，HER2+）同源肿瘤移植小鼠模型（Syngenic），发现显著增加了荷瘤小鼠体内中央记忆型T细胞样表型(表现为CD62L+、CD44+)和细胞的持久性。通过RNA-seq、染色质测序(ATAC-seq)等数据分析，发现在IL-15培养条件下CAR-T细胞基因组区域内FOXO1结合基序显著增多。

研究者使用敲除FOXO1基因的抗HER2-CAR-T细胞治疗荷瘤小鼠（E0771 HER2+），发现抗HER2-CAR-T细胞中CD62L和TCF7的表达显著降低；与E0771（HER2+）肿瘤细胞连续共培养后，导致免疫检查点TIM3、PD-1和LAG3的表达显著增加，共同表明FOXO1基因缺失的CAR-T细胞向更短期的效应细胞表型转变。 

2.FOXO1增强CAR-T细胞功能 

因为传统CAR-T细胞在经历多轮抗原刺激后，由于衰竭或功能障碍而失去分泌IFNγ和TNF的能力，从而限制了CAR-T细胞功能。

为了研究FOXO1过表达CAR-T细胞的功能和表型，研究者构建了过表达FOXO1-ada（FOXO1的组成型活性变体）和TCF7、ID3、JUN（均为转录调节因子）的小鼠抗HER2 CAR-T细胞，并使用E0771（HER2+）肿瘤细胞刺激过表达 CAR-T细胞，结果发现FOXO1-ada、TCF7过表达导致IFNγ和TNF显著增加；FOXO1-ada、JUN、TCF7过表达导致颗粒酶B的表达增加，表明细胞杀伤能力增强；FOXO1-ada、TCF7、ID3、JUN过表达导致CAR-T细胞数量显著增加，并维持低分化程度CAR-T细胞表型。 

3.FOXO1增强CAR-T细胞在体内的功效 

研究者构建了乳腺上皮和脑组织过表达HER2的转基因C57BL/6小鼠，并使用该小鼠建立原位E0771(HER2+)和皮下MC38(HER2+)Syngenic模型。

使用野生型FOXO1、FOXO1-ada、JUN、TCF7过表达的小鼠抗HER2-CAR-T细胞治疗荷瘤小鼠，结果发现小鼠肿瘤体积显著减小（图a~c）、存活率显著增加（图d)，但野生型FOXO1的过表达并没有显著提高治疗效果（图e），这表明组成型活性形式对于改善小鼠CAR-T细胞的功能是必要的。 

研究者从治疗9天的荷瘤小鼠肿瘤引流淋巴结(Draining lymph node，DLN)中分离抗HER2-CAR-T细胞并分析其体内细胞表型。与对照组CAR-T细胞比，过表达FOXO1-ada的抗HER2-CAR-T细胞显著增加了促炎细胞因子IFNγ和TNF的表达(图a)；其PD-1、TIM3表达水平与未过表达对照组抗HER2 CAR-T细胞表达水平相似。 

将过度表达FOXO1-ada的抗HER2-CAR-T细胞与抗PD-1联合治疗，与仅用对照组抗HER2-CAR-T细胞相比，能显著提高抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，表明过表达FOXO1-ada CAR-T细胞与PD-1阻断有协同作用（图d）。 

前期数据表明FOXO1-ada过表达导致细胞因子表达增加，因此研究者探究了细胞因子IFNγ对过表达FOXO1-ada的抗HER2 CAR-T细胞产生治疗活性时的作用，结果表明IFNγ阻断消除了过表达FOXO1-ada的抗HER2 CAR-T细胞产生治疗活性（图c）。 

为了解转录调节因子过表达的CAR-T细胞治疗荷瘤小鼠后对细胞代谢功能的影响，研究者对肿瘤内CD8+ CAR-T细胞进行线粒体染色，结果发现过表达TCF7、FOXO1-ada的抗HER2  CAR-T细胞表现出较高的MDR和MG染色强度，表明膜电位和线粒体质量得到调节，含有功能性线粒体细胞比例增加（图d,e）。 

综上，抗HER2CAR-T细胞中FOXO1-ada的过表达有助于通过促进T细胞多功能性、增殖和线粒体功能性来增强体内抗肿瘤活性。 

4.FOXO1提高人源CAR-T细胞的干细胞性 

FOXO1-ada过表达的抗HER2 CAR-T细胞分化程度较低，CD62L+ 、CD27+、CD45RA+表型细胞的数量增加，同时耗竭标记物LAG3和TIM3的表达减少。

后续研究者构建了过表达FOXO1-ada的靶向Lewis Y的CAR-T细胞（重组人源细胞），发现其产生IFNγ和TNF的能力显著减弱，表明组成型活性FOXO1的表达限制了靶向Lewis Y的CAR-T细胞获得完全效应功能。

研究者构建过表达野生型FOXO1、TCF7和ID3的靶向Lewis Y的CAR-T细胞，发现野生型FOXO1诱导CD45RA+、CD62L+、CD8+表型的人CAR-T细胞效果显著，通过敲除靶向Lewis Y的CAR-T细胞中FOXO1位点，导致CD62L表达缺失，延长培养后CAR-T细胞增殖速度减慢，与肿瘤细胞共培养后IFNγ的表达受损。 

 5.过表达FOXO1对人源 CAR-T细胞转录组的影响 

为了进一步了解过表达FOXO1引起人CAR-T细胞表型分化的机制，研究者使用RNA测序技术分析了CD8+和CD4+表型的人CAR-T细胞。研究发现过表达FOXO1的CD8+ CAR-T细胞在静止状态下表达较少的与T细胞分化、免疫检查点相关的基因；在抗原刺激后（比如与肿瘤细胞共同培养后），CD4+、CD8+表型的 CAR-T细胞会表现出更高的糖酵解基因表达，细胞代谢水平提高。

 研究者对靶向Lewis Y的CAR-T细胞与MCF7（人乳腺癌细胞系，Lewis Y +）肿瘤细胞共培养前后进行了scRNA-seq分析，FOXO1的表达增加了高表达KLF2、SELL和IL7R为特征的CD8+ CAR T细胞比例，且表达高水平的CCR7（与癌细胞迁移相关）；减少了高表达IFITM3和TNFSF10（抗病毒相关）为特征的CD8+ CAR-T细胞比例。 

6.过表达FOXO1对人源CAR-T细胞的表观遗传学分析 

研究发现在FOXO1过表达的人CAR-T细胞中，有大量染色质区域的可及性发生了变化，导致对免疫检查点基因表达(如PDCD1, ENTPD1和TIGIT)转录起始位点附近区域的可及性降低(图4b)；此外，FOXO1影响了某些转录因子（如AP-1和NF-kB）结合的区域的可及性，这可能与T细胞静止状态有关。在激活状态下，FOXO1过表达的细胞在染色质可及性方面的变化相对较少。

FOXO1导致人CAR-T细胞表观遗传发生变化，但当细胞接受刺激后依旧向效应细胞表型转变。这表明FOXO1虽然促进了人CAR-T细胞的干细胞样表型，但不影响人CAR-T细胞被激活时的表观遗传重编程。 

 7.FOXO1 提高了靶向Lewis Y的CAR-T细胞治疗效果 

研究者构建了TCF7、ID3和FOXO1过表达的靶向Lewis Y的CAR-T细胞，并用于治疗OVCAR-3（人卵巢癌细胞系，Lewis Y +）荷瘤小鼠，结果显示FOXO1过表达增强了CAR-T细胞的功效，肿瘤体积显著减小(图a)，并且小鼠血液和脾脏中CD8+和CD4+ CAR-T细胞数量显著增加(图b、c)。FOXO1、TCF7的过表达显著降低了肿瘤浸润性CD8+ CAR-T细胞上衰竭标志物PD-1和TIM3的表达量，而Ki-67的表达量不变。 

研究者提取了6名接受靶向Lewis Y CAR-T细胞治疗的实体癌患者的CAR-T细胞，用于评估FOXO1过表达的人CAR-T细胞疗法，FOXO1过表达导致CD45RA+ CD62L+干细胞样T细胞数量增加，TIM3和CD39表达降低。与健康供体来源的CAR-T细胞一致，患者来源的CAR-T细胞中FOXO1的过表达会导致细胞线粒体最大呼吸频率和备用呼吸能力显著增强(图k)。 

研究者使用其中两名患者的CAR-T细胞治疗OVCAR-3荷瘤小鼠，FOXO1在患者来源的CAR-T细胞中的表达显著增加了治疗小鼠脾脏和肿瘤中CAR-T细胞的数量(图i)。并在脾脏中表现出CD45RA+ CD62L+干细胞样表型的CAR-T比例增加(图m)，在肿瘤中表现出较少细胞耗竭表型，其特征是PD-1和TIM3的表达减少(图n)，表明FOXO1过表达可以类似地调节患者来源的CAR-T细胞向低分化表型转变。 

结论

本研究发现FOXO1过表达可以促进CAR-T细胞多功能性、改善CAR-T细胞线粒体健康和并维持细胞功能的持久性、促进CAR-T细胞向干细胞样表型转变；且FOXO1过表达不阻碍CAR-T细胞在激活时的表观基因组。过表达FOXO1为提高CAR-T细胞治疗实体肿瘤的疗效提供了新的思路。 

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南昌乐悠生物科技有限公司是一家专业从事肿瘤动物模型构建及抗癌新药临床前药效评价的国家高新技术企业，已经为包括小分子靶向药、大分子靶向药（包括ADC）、溶瘤病毒、细胞药物（TIL、γδT）等多种抗癌新药研发提供了有力的支持，其中部分药物已经进入临床试验申请(IND)阶段。 

REFERENCE：Chan JD, Scheffler CM, Munoz I, Sek K, Lee JN, Huang YK, Yap KM, Saw NYL, Li J, Chen AXY, Chan CW, Derrick EB, Todd KL, Tong J, Dunbar PA, Li J, Hoang TX, de Menezes MN, Petley EV, Kim JS, Nguyen D, Leung PSK, So J, Deguit C, Zhu J, House IG, Kats LM, Scott AM, Solomon BJ, Harrison SJ, Oliaro J, Parish IA, Quinn KM, Neeson PJ, Slaney CY, Lai J, Beavis PA, Darcy PK. FOXO1 enhances CAR T cell stemness, metabolic fitness and efficacy. Nature. 2024 May;629(8010):201-210. doi: 10.1038/s41586-024-07242-1. Epub 2024 Apr 10. PMID: 38600376; PMCID: PMC11062918.