首先研究人员通过Ang II皮下缓释诱导的小鼠血管重塑模型。为了评估EndoMT在血管重塑中的发生情况，选取省里盐水或Ang II缓释7天的小鼠胸主动脉进行检测。En face免疫荧光染色显示，与生理盐水处理的小鼠相比，Ang II缓释后VE-cadherin（ECs标志物）的表达明显减少，而Vimentin（间充质细胞标志物）的表达明显增加，提示EndoMT过程被激活。此外，在Ang II缓释的小鼠胸主动脉内皮层观察到TGF-β1信号中间体SMAD2的磷酸化增加。以上结果表明，在Ang II诱导的血管重塑过程中，内皮TGF-β/SMAD2信号和EndoMT过程被激活。 

图1 VR病理状态下EndoMT过程和内皮TGF-β1/SMAD2信号被激活^[1] 

随后，研究人员发现Ang II缓释的小鼠主动脉内皮中糖酵解关键酶PFKFB3的表达显著升高。通过使用TGF-β1刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）诱导EndoMT，细胞明场拍照结果显示TGF-β1处理使HUVECs表现为成纤维或间充质细胞的形态，同时细胞的伸长指数也显著升高。此外，与动物水平的结果一致，TGF-β1体外处理显著增加了糖酵解关键酶PFKFB3的表达水平。海马细胞外通量分析也提示TGF-β1处理的HUVECs中基础糖酵解、糖酵解能力、最大糖酵解和糖酵解储备均有所增加；基因敲除PFKFB3能显著降低TGF-β1诱导的细胞糖酵解水平升高。 

为了进一步探究TGF-β1诱导PFKFB3蛋白表达升高的机制，研究人员使用JASPAR软件分析了PFKFB3的启动子区域，并发现了两个SMAD2/3结合元件（SMAD2/3 binding elements, SBEs）。进一步使用抗SMAD2/3的抗体进行染色质免疫共沉淀（ChIP）实验发现，SMAD2/3能够与PFKFB3上包含SEBs的启动子区域结合，而且这种结合在TGF-β1处理后显著增加。此外，荧光素酶报告基因实验表明，SMAD2/3的过表达以剂量依赖性的方式显著增加PFKFB3的启动子活性，进一步证明PFKFB3是SMAD2/3复合物的转录靶标。 

综上所述，在EndoMT过程中，TGF-β1/SMAD2信号通过转录激活PFKFB3基因，诱导内皮糖酵解升高。 

图2 EndoMT过程伴随PFKFB3介导的糖酵解增加^[1] 

为了剖析内皮PFKFB3上调在Ang II诱导的血管重塑中的功能性作用，研究人员构建了他莫昔芬诱导的内皮特异性Pfkfb3敲除（Pfkfb3^iECKO）和对照组（Pfkfb3^fl/fl）小鼠。将Pfkfb3^fl/fl和Pfkfb3^iECKO小鼠经Ang II皮下缓释14天后，进行组织学染色和分析。而经Ang II缓释后，Pfkfb3^fl/fl小鼠胸主动脉的中膜和外膜胶原含量、中膜厚度、以及外层弹性纤维（EEL）周长显著增加；然而，所有这些病理特征在Pfkfb3^iECKO小鼠中都得到改善。此外，en face染色显示PFKFB3缺失显著抑制了Ang II诱导的EndoMT过程和p-SMAD2水平的升高。以上结果表明内皮PFKFB3缺乏能够减轻Ang II诱导的主动脉重塑和EndoMT。 

图3 内皮PFKFB3介导EndoMT和VR形成^[1] 

此前的证据表明NADH/NAD⁺比率增加与糖酵解的热力学耦合，在基因转录中发挥着根本性的作用。研究人员首先发现，TGF-β1处理显著提高HUVECs中的NADH含量和NADH/NAD⁺比率，基因敲除或PFK158药物抑制PFKFB3则能逆转这一变化，但均不影响NAD⁺的水平。为了明确NADH/NAD⁺比率增加与EndoMT之间的功能关系，研究人员使用4-甲硫基-2-氧代丁酸（MTOB）耗竭胞内NADH，结果发现逆转了ECs中间充质细胞标志物的上调和内皮标志物的下调。羧基末端结合蛋白1（CtBP1）是一种众所周知的NADH敏感型的蛋白，并被证实可作为转录共抑制因子调控基因转录。SiRNA敲除CtBP1能够模拟PFKFB3缺失的抑制EndoMT效应。随后，研究人员通过构建对NADH不敏感的CtBP1突变体（CtBP1^G183A），发现过表达CtBP1^G183A几乎完全逆转TGF-β1诱导的EndoMT过程（其中使用的AAV9-CDH5>Ctbp1（WT）和AAV9-CDH5>Ctbp1（G183A）病毒由赛业生物提供）。综上所述，这些数据表明PFKFB3驱动的糖酵解以NADH/CtBP1依赖性的方式正向调控EndoMT。 

图4 NADH依赖性的CtBP1激活对于EndoMT的诱导至关重要^[1] 

为了更深入地探究糖酵解依赖性的CtBP1激活如何调控EndoMT过程，研究人员发现敲除PFKFB3或CtBP1均能够减轻TGF-β1诱导的SMAD2磷酸化。随后，通过筛选一系列经典的TGF-β1/SMAD2信号的调控因子，研究人员筛选出SMAD泛素调节因子2（SMURF2）是潜在的PFKFB3/NADH/CtBP1轴的作用靶点。过表达野生型CtBP1^WT能够剂量依赖性降低SMURF2的表达；然而，过表达突变型CtBP1^G183A则逆转了对SMURF2的抑制作用。敲除SMURF2能够消除PFKFB3缺失对SMAD2信号的去激活作用。综上所述，PFKFB3/NADH/CtBP1轴通过抑制SMURF2的表达激活TGF-β1/SMAD2信号通路。 

图5 PFKFB3/NADH/CtBP1轴通过抑制SMURF2促进EndoMT^[1] 

CtBP1作为转录共抑制因子，既往研究报道CtBP1介导的转录抑制功能依赖于CtBP1与其他转录抑制因子的结合。研究人员通过大数据筛选发现E2F4是CtBP1发挥抑制作用潜在的转录抑制因子。免疫共沉淀（Co-IP）和Re-ChIP实验共同表明CtBP1与E2F4能够直接结合，并形成转录复合物与SMURF2启动子结合。PFKFB3敲除或MTOB处理能够抑制以上结合。荧光素酶报告基因实验则进一步提示E2F4过表达抑制能够SMURF2启动子区域的活性，野生型（WT）而非突变型（G183A）CtBP1的过表达明显加强TGF-β1处理下E2F4的抑制作用。这些数据表明CtBP1与E2F4结合共同转录抑制了SMURF2在TGF-β1处理下的表达。

图6 CtBP1/E2F4复合物转录抑制SMURF2的表达^[1] 

此项研究首次证实内皮PFKFB3介导的糖酵解通过调控EndoMT促进VR过程。机制探索表明糖酵解依赖性的NADH水平升高介导了CtBP1/E2F4转录复合物对TGF-β1/SMAD2信号负性调控因子SMURF2的转录抑制，进而促进EndoMT和VR。此项研究也首次阐明干预内皮细胞PFKFB3或CtBP1活性可以缓解VR，为VR的防治提供了新的干预靶点。 

图7 机制图^[1]