Impact factor: 9.7（2022）

Published online：2024-1-28 

研究背景      

胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是胰腺癌的主要组织学类型，占胰腺癌的85%以上。PDAC对化疗药物，特别是吉西他滨(gemcitabine)有较高的原发性耐药性。尽管吉西他滨作为一线化疗药物，但大多数患者对吉西他滨治疗无效，中位生存时间短。CSNK2A1是一种组成活性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化多种底物和调节多种信号通路发挥作用，其失调与多种人类疾病有关。通过生物信息学分析，发现CSNK2A1在吉西他滨耐药的PDAC中表达升高，并通过多种机制促进PDAC对吉西他滨的耐药性。本文通促进或沉默CSNK2A1表达、建立患者来源的异种移植模型（Patient-derivedxenografts，PDX）等来研究PDAC对吉西他滨的耐药机制，为克服PDAC的吉西他滨耐药性提供了新思路。 

研究结果

1、CSNK2A1是吉西他滨耐药PDAC患者的潜在预测因子   

为了确定治疗耐吉西他滨的PDAC的新靶点，研究者进行了对吉西他滨耐药与敏感的PDAC细胞系的全面分析。结果显示耐药的PDAC细胞中有1979个基因表达上调（图A、B），通过与两个GEO数据库和癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库进行联合分析，我们观察到在耐吉西他滨的PDAC细胞和肿瘤组织中CSNK2A1的表达显著升高（图C-E）。CSNK2A1表达量与接受吉西他滨治疗患者的预后呈负相关（图1F）。 

为了进一步验证，研究者收集了17个化疗耐药和4个化疗敏感的组织样本，用来检查CSNK2A1表达与PDAC中吉西他滨耐药之间的相关性。结果显示，在化疗耐药的组织样本中CSNK2A1的表达显著较高（图G-I）。此外，为了在PDAC中验证CSNK2A1与吉西他滨耐药之间的直接关联，研究者用已成功建立的PDAC PDX模型进行药物试验（图J）。结果发现PDX #09的药物抑制效果显著高于PDX #01，随后这两个PDX模型分别为吉西他滨敏感和吉西他滨耐药。在吉西他滨耐药的PDX模型中CSNK2A1的表达水平显著高于吉西他滨敏感的PDX模型（图M）。这些结果表明，CSNK2A1有望作为PDAC患者吉西他滨耐药的预测标志物。

2、P300通过调节H3K27ac修饰促进CSNK2A1在吉西他滨耐药PDAC中的过表达  

研究者发现在CSNK2A1启动子区域的H3K27ac信号显著富集，表明染色质乙酰化可潜在调节PDAC中CSNK2A1的表达（图A）。研究发现组蛋白乙酰转移酶P300与CSNK2A1的相关系数最高，免疫组化染色结果显示P300在吉西他滨耐药组织样本中的表达水平明显较高(图B-C)。随后，用P300抑制剂C646治疗耐吉西他滨PDAC细胞导致CSNK2A1 mRNA表达降低(图D、E)。

通过敲除P300基因，可观察到细胞中CSNK2A1 mRNA水平显著下降(图F、G)，这些结果在蛋白水平上也得到了证实(图H、I)。染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）结果显示，CSNK2A1的启动子区域富含P300信号，敲低P300基因可显著降低CSNK2A1启动子中H3K27ac信号的富集（图J、K ）。这些结果表明P300通过调节H3K27ac修饰促进了CSNK2A1在吉西他滨耐药PDAC中的过度表达，针对P300-CSNK2A1通路可能有助于克服吉西他滨耐药。 

3、CSNK2A1基因下调增强了PDAC耐药细胞对吉西他滨的敏感性 

为了研究CSNK2A1在耐药吉西他滨PDAC中的潜在作用，研究人员通过渐增加培养液中吉西他滨的药物剂量，建立了耐吉西他滨的PDAC细胞系（图A、B），吉西他滨处理以剂量依赖性在PDAC耐药细胞中增加了CSNK2A1的表达（图C）。为了探讨CSNK2A1在吉西他滨耐药细胞中的功能影响，研究人员使用短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）在PDAC吉西他滨耐药细胞中稳定敲减CSNK2A1。通过qRT-PCR和WB验证了CSNK2A1表达量的降低（图D、E）。

研究人员测定了细胞系吉西他滨的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50），结果显示CSNK2A1敲减显著降低了吉西他滨耐药PDAC细胞的IC50浓度（图F），且在特定浓度的吉西他滨药物处理下，CSNK2A1的下调显著抑制了吉西他滨耐药细胞的增殖（图G）。平板集落形成实验结果显示，CSNK2A1的下调损伤了耐吉西他滨PDAC细胞平板克隆形成的能力(图H)；CSNK2A1敲低也显著促进了吉西他滨诱导的癌细胞凋亡（图I）。 

4、体内抑制CSNK2A1表达可促进PDAC对吉西他滨的敏感性

为评估CSNK2A1变化对体内吉西他滨敏感性的影响，研究人员将5 × 10⁶个转染shControl或shCSNK2A1的BxPC-3(GR)和CFPAC-1 (GR)细胞皮下接种于每只小鼠的左腹侧。将小鼠分为5组，每组5只，肿瘤形成后，小鼠腹腔注射吉西他滨(25 mg/kg)或等体积PBS，每4天注射一次，共24天。吉西他滨治疗24天后，与体外研究结果一致，CSNK2A1敲低组与对照组相比，肿瘤体积和重量显著减少(图A-C)，四组小鼠的体重没有显著差异，这表明CSNK2A1耗损没有引起显著的全身毒性(图D)。  

CSNK2A1敲除后，吉西他滨治疗组的Ki67表达最低(图E)，表明在CSNK2A1抑制的背景下，吉西他滨治疗抑制了PDAC细胞增殖；通过TUNEL实验评估凋亡细胞数量，发现吉西他滨治疗后，CSNK2A1敲低组的凋亡细胞显著增加(图F)。这些结果证明CSNK2A1的缺失显著增强了PDAC对吉西他滨的敏感性。 

5、CSNK2A1通过MAPK途径增强自噬，促进PDAC的吉西他滨耐药 

研究者分析了两个数据库（TCGA和GDSC），发现表达高水平CSNK2A1和低水平CSNK2A1的PDAC细胞之间差异表达的基因在自噬相关通路中富集（图A）。通过降低CSNK2A1的表达，研究者观察到与自噬相关的标记物表达变化，例如SQSTM1增加和LC3II减少（图B、C）；电镜检查也显示自噬体数量减少（图D、E）。 

Silmitasertib是一种成熟的CSNK2A1抑制剂，用Silmitasertib处理吉西他滨耐药细胞后，磷酸化mTOR、ERK和SQSTM1蛋白水平升高，而CSNK2A1和LC3II蛋白水平降低(图F)。免疫荧光共聚焦结果显示Silmitasertib处理后自噬减弱(图G、H)。 

耐吉西他滨PDAC细胞表达的LC3II、自噬体和自噬通量水平明显高于敏感细胞，表明耐吉西他滨PDAC细胞的自噬活性明显增强(图A-C)。 

此外，在吉西他滨治疗后，耐吉西他滨PDAC细胞中LC3II水平呈剂量依赖性增加(图D、E)。使用荧光共聚焦显微镜监测自噬通量，检测到吉西他滨对自噬和自噬通量的剂量依赖性增加(图F)。综上所述，CSNK2A1通过MAPK途径增强自噬，促进PDAC的吉西他滨耐药。 

6、CSNK2A1抑制剂Silmitasertib与吉西他滨对PDAC具有协同治疗作用    

为评估CSNK2A1抑制剂Silmitasertib与吉西他滨联合治疗的药物联合指数（Combination Index，CI）。结果显示，当两种药物同时施用于耐吉西他滨的PDAC细胞时，具有良好的协同治疗效果(图A-D)。为评估Silmitasertib联合吉西他滨与单药治疗相比的效果，研究者进行了细胞活力、克隆形成和细胞凋亡测定。研究结果显示，Silmitasertib和吉西他滨联合治疗显著抑制了吉西他滨耐药细胞的增殖和集落形成能力(图E-G)。

通过流式细胞术分析细胞凋亡，联合治疗显著增加了吉西他滨耐药细胞中的凋亡细胞数量(图H)。这些实验结果表明，Silmitasertib与吉西他滨联合治疗对PDAC具有协同治疗作用。 

7、Silmitasertib与吉西他滨联合增强对吉西他滨耐药PDAC PDXs的治疗效果

将新鲜的PDAC组织大小切成3 mm × 3 mm × 3 mm，皮下移植到B-NDG小鼠的左侧，建立P1代 PDX，通过传代获得P3代次。选择耐吉西他滨PDX模型进行体内联合用药实验，将新鲜的P3 - PDX肿瘤组织切成小块，皮下移植到4周龄雌性BALB/ c裸鼠的左侧。小鼠被随机分为四个治疗组：(1)PBS、 (2) Silmitasertib、(3)吉西他滨、(4)药物2和3的组合，每组5只。吉西他滨和Silmitasertib分别以25和125 mg/kg的剂量腹腔注射，每3天1次，共24天。

治疗24天后，Silmitasertib联合吉西他滨显著抑制了吉西他滨耐药PDX肿瘤的增殖，而对小鼠的体重、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏没有任何明显的不良影响(图8A-D)。 

免疫组化染色进一步显示联合组表现出，联合用药组的Ki67和LC3表达最低，表明肿瘤增殖降低(图E)。此外，凋亡小体TUNEL染色显示联合用药组TUNEL阳性细胞数量显著增加，表明细胞凋亡增强(图F)。 

这些结果共同表明，Silmitasertib和吉西他滨联合可用于治疗过表达CSNK2A1的PDAC(图G)。

 结论 

在本研究中发现PDAC的CSNK2A1的过表达与吉西他滨的耐药性相关，CSNK2A1通过MAPK途径增强自噬，促进PDAC的吉西他滨耐药，可在吉西他滨耐药性的PDAC PDX模型中检测到CSNK2A1的表达水平明显升高。本研究还发现，P300的选择性敲除导致CSNK2A1 mRNA水平显著下降，证实了P300对CSNK2A1表达的调控，并提出了通过干预P300-CSNK2A1通路来克服PDAC对吉西他滨的耐药性的潜在治疗策略；CSNK2A1抑制剂Silmitasertib联合吉西他滨显著抑制了吉西他滨耐药PDX肿瘤的增殖，Silmitasertib联合吉西他滨可用于治疗过表达CSNK2A1的PDAC。 

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REFERENCE：Liu ZD, Shi YH, Xu QC, Zhao GY, Zhu YQ, Li FX, Ma MJ, Ye JY, Huang XT, Wang XY, Xu X, Wang JQ, Zhao W, Yin XY. CSNK2A1 confers gemcitabine resistance to pancreatic ductal adenocarcinoma via inducing autophagy. Cancer Lett. 2024 Mar 31;585:216640. doi: 10.1016/j.canlet.2024.216640. Epub 2024 Jan 28. PMID: 38290659.