Impact factor: 7.5（2022）

Published online：2022-12-8 

研究背景

溶瘤病毒（Oncolytic Virus,OV），是一种天然或经过基因改造的病毒，选择性地感染肿瘤细胞，在其内部大量复制并最终裂解肿瘤细胞，达到直接溶瘤的效果。溶瘤病毒会大量释放肿瘤抗原，改善肿瘤微环境，刺激机体产生抗肿瘤免疫反应来持续发挥抗癌功效。本研究以西尼罗病毒(West Nile virus,WNV）为模板，利用分子生物学手段将基因组非编码区3 ʹ UTR的非复制必须区域替换为poly(A)序列开发新型减毒溶瘤病毒WNV-poly(A），以期达到减毒增效的目的。作者通过多种肿瘤细胞株体外杀伤实验、细胞株移植瘤体内药效实验、水凝胶包被肿瘤组织培养药敏试验（Hydrogel embedded histoculture drug sensitivity test，HDST）和患者源性异种移植模型（Patient-derived xenografts ，PDX）体内药效实验来评估新型溶瘤病毒WNV-poly(A）对不同肿瘤的体内外杀伤作用。 

研究结果

1.WNV-poly(A)选择性地杀伤癌细胞

为了探索WNV-poly(A)的溶瘤潜能，研究者探索了WNV-poly(A)感染对人类和小鼠各种癌细胞和正常细胞生存能力的影响。13个癌细胞系中有8个细胞系(Huh7、A549、B16F1、SKOV3、A375、A2058、PC9和Hale)表现出典型的细胞毒性形态学变化；感染后对正常细胞(MLE-12、MEF和L-02)的细胞形态无明显影响(图A)。 

研究者通过CCK-8试剂盒测定了不同MOI(0.001 ~ 10)范围内WNV-poly(A)感染对肿瘤细胞(Huh7、B16F1、SKOV3、Hale和A549)和正常细胞(MLE-12、MEF和L-02)的细胞毒性作用，结果显示，尽管在不同肿瘤细胞中的细胞毒性不同，但WNV-poly(A)对这些肿瘤细胞具有一致的剂量依赖性细胞毒性作用，但对正常细胞无明显作用(图B)。

为了进一步确定WNV-poly(A)选择性杀伤癌细胞的功能，研究者将肿瘤细胞(B16F1和Huh7)与正常成纤维细胞(MEF)在含有WNV-poly(A)的培养基中共同培养，结果发现WNV-poly(A)仅对共培养系统中的肿瘤细胞具有细胞毒性作用(图C)。

研究者首先比较了WNV-poly(A)在肿瘤细胞(B16F1和Huh7)和正常细胞(MEF)中的复制效率。结果发现，WNV-poly (A)在肿瘤细胞中比在正常细胞中能更有效地复制 (图D)。

研究者研究了IFN-І信号通路的缺乏是否会导致肿瘤细胞对WNV-poly(A)的敏感性增加。如图E所示， WNV-poly(A)抗性正常细胞(MEF)的IFN-α mRNA表达水平显著升高，而WNV-poly(A)敏感性肿瘤细胞(B16F1、Huh7和SKOV3)的IFN-α mRNA表达水平未显著升高(图E)。在B16F1细胞中，IFN-α预处理后可抑制WNV-poly(A)病毒诱导的肿瘤细胞溶解(图F)，以IFN-α剂量依赖的方式减少病毒复制(图G)。 

2.瘤内注射WNV-poly(A)可有效抑制B16F1荷瘤小鼠肿瘤生长    

研究者使用B16F1（小鼠黑色素瘤细胞） 荷瘤小鼠评估了WNV-poly(A)的体内抗肿瘤作用。当C57BL/6小鼠肿瘤大小达到约100 mm³后，瘤内注射不同剂量的WNV-poly(A) 及经紫外线灭活的WNV-poly(A)。研究发现，WNV-poly(A)治疗以剂量依赖的方式延缓了肿瘤进展(图B)，其特征是感染后15天内测量的肿瘤体积(图C)和肿瘤重量(图D)随时间的变化，紫外线灭活的病毒颗粒未能抑制肿瘤生长。HE染色后，WNV-poly(A)处理的肿瘤观察到明显的肿瘤坏死(图E)。

研究者评估了WNV-poly(A)在B16F1荷瘤小鼠中的病毒滴度。瘤内给药1 × 10⁷ PFU WNV-poly(A)后，滴度峰值出现在第3天，此后病毒载量尽管不断下降，但仍保持在> 10² PFU水平直至第9天(图F)。

取第5天肿瘤组织进行分析，WB和IF均显示，WNV-poly(A)处理后诱导肿瘤组织中Cleaved caspase 3显著增加(图G, H)。

WNV-NS2b（WNV的标记物） IF信号与 TUNEL阳性信号高度重叠，进一步表明在B16F1荷瘤小鼠中观察到的溶瘤作用是由WNV-poly(A)感染引起的(图I)。第五天肿瘤中肿瘤增殖标志物Ki67与WNV-NS2b明显减少，而且与WNV-NS2b没有共定位(图J)。上述结果表明，WNV-poly(A)可在肿瘤中增殖，并通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥溶瘤作用。在整个观察期(15天)，WNV-poly(A)处理对小鼠的健康状况和体重都没有明显的有害影响。 

3.重复给药可以增强WNV-poly(A)在小鼠体内的溶瘤作用    

为了增强WNV-poly(A)的溶瘤作用，研究者对B16F1荷瘤小鼠瘤内注射10⁷ PFU WNV-poly(A)，每次间隔3天，并与单剂量治疗的抗肿瘤效果进行比较(图A)。与单剂量治疗相比，多剂量治疗对肿瘤生长的抑制效果更好(图B-D)。   

与单次给药相比，多次给药导致更多的肿瘤多灶性坏死(图E)；肿瘤组织中免疫细胞的浸润(黄色箭头)更多(图E)， CD45免疫荧光染色结果进一步证实，多次给药组肿瘤样本中CD45+细胞的百分比明显更高(图F)。这些数据表明，多剂量治疗对B16F1小鼠黑色素瘤生长的抑制作用比单次注射更强。

4.WNV-poly(A)多剂量治疗导致肿瘤免疫微环境的重塑

为了证明WNV-poly(A)在抗肿瘤活性中的免疫应答，研究者通过流式细胞术量化了多剂量WNV-poly(A)治疗后B16F1荷瘤小鼠肿瘤浸润和脾细胞中免疫细胞的比例，结果显示WNV-poly(A)治疗显著增加了免疫细胞对肿瘤组织的浸润，可达到15%，而未治疗的肿瘤为5%(图A)。具体而言，CD8+T细胞占白细胞的比例明显增加，CD4+T细胞和DC细胞略有增加，而NK细胞、Treg细胞或巨噬细胞在肿瘤组织中几乎不受影响(图B)。 

进一步分析发现，Ly6C+DC和Ly6G+DC的比例高度上调(图C)；CD8+T细胞的比例显著升高(图D)。在脾脏中，也发现DC的比例显著增加，尽管CD8+T细胞没有改变(图E-G)。这些数据表明，多剂量WNV-poly(A)治疗可以激活肿瘤浸润性DC和CD8+T细胞，并在肿瘤组织中引发增强的免疫反应。

5.WNV-poly(A)的抗肿瘤作用需要CD8+T细胞介导

研究者通过腹腔注射抗小鼠CD8抗体来消耗CD8+T细胞，同时使用抗小鼠CD4抗体和抗小鼠NK1.1抗体分别消耗CD4+T细胞和NK细胞。结果显示，小鼠全身耗竭CD8+T细胞会减弱WNV-poly的抗肿瘤活性(A)，而耗竭CD4+T细胞或NK细胞的小鼠对肿瘤消退几乎没有影响(图H,I)。这些结果表明，CD8+T细胞是WNV-poly(A)介导的针对黑色素瘤的抗肿瘤免疫反应所必需的。后续还证实灭活病毒对肿瘤治疗无效，不引起免疫刺激， WNV-poly(A) 活病毒诱导的抗肿瘤作用需要CD8+T细胞介导。

研究者给双侧皮下接瘤的B16F1荷瘤小鼠的一侧瘤内注射溶瘤病毒，观察对侧肿瘤(未注射病毒)是否也能得到控制(图A)。结果显示，给左侧瘤内注射溶瘤病毒右侧肿瘤生长也明显抑制(图B-F)，其右侧肿瘤体积与对照组右侧肿瘤体积比有明显差异(图B、D和F)。 

研究者使用流式细胞术评估对侧肿瘤的免疫反应，观察到WNV-poly(A)处理显著增加了免疫细胞向无病毒的对侧肿瘤组织的浸润(图H)，CD8+T细胞占白细胞的比例显著增加(图I)，其中效应CD8+T细胞表型升高(图J)。综上所述，WNV-poly(A)对远端肿瘤的治疗效果证明了肿瘤抗原特异性免疫应答在WNV-poly(A)治疗中的重要作用。

6.WNV-poly(A)具有广谱溶瘤作用

鉴于WNV-poly(A)在多种肿瘤细胞中具有显著的体外细胞毒作用，研究者建立了人类黑色素瘤A375、卵巢癌SKOV3和肝癌Huh7细胞系的CDX模型，以评估WNV-poly(A)在这些人类肿瘤CDX模型中的溶瘤活性。通过多次给药WNV-poly(A)后发现，所有组肿瘤体积均显著减小（图A~C）。在Huh7模型中，瘤内给药5次WNV-poly(A)后（3天一次），小鼠存活时间明显延长(图D)。这些结果进一步说明了WNV-poly(A)具有广谱溶瘤作用。

7.静脉给药WNV-poly(A)显示出与肿瘤内给药相当的抗肿瘤效果

研究者通过静脉注射、肌肉注射和肿瘤内给药方式对Huh7肝癌荷瘤小鼠进行了WNV-poly(A)给药，并比较了它们的抗肿瘤效果。结果表明，静脉给药对肿瘤生长有明显的抑制作用，与瘤内注射一致，而肌内给药无溶瘤作用(图E)，结果提示了WNV-poly(A)在转移性和系统性肿瘤治疗中的潜在应用。

8.WNV-poly(A)对多种患者源性肿瘤组织具有显著的溶瘤作用

为了进一步研究WNV-poly(A)对人类肿瘤的溶瘤作用，研究者使用临床相关人类肿瘤组织的PDX模型为基础进行HDST实验，包含10种不同类型的肿瘤组织(黑色素瘤、卵巢癌、肝细胞癌、肺癌、胃癌、横纹肌肉瘤组织、神经母细胞瘤、胆囊癌组织、胆管癌和乳腺恶性叶状瘤)，发现WNV-poly(A)对所有测试的肿瘤都有显著的溶瘤作用(图B)。

为了进一步证实WNVpoly(A)对人类肿瘤的作用，研究者使用肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC) PDX小鼠模型进行了WNV-poly(A)的疗效研究。与对照组相比，WNV-poly(A)组表现出明显的肿瘤生长抑制(图C)。用WNV-poly (A)治疗后，从注射后第8天到第14天，肿瘤体积显著减少(图D)。WNV-poly(A)组的肿瘤重量明显小于对照组(图E)。肿瘤组织HE染色结果显示，WNV-poly(A)处理诱导了明显的肿瘤组织坏死(图F)。实验过程中两组的体重没有明显变化(图G)，WNV-poly(A)仅在肿瘤组织中检测到(图H)。

结论

本研究显示新型减毒溶瘤病毒WNV-poly(A）特异性地感染和杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞活性无明显影响，这种选择性杀伤与肿瘤细胞IFN-I信号传导缺陷相关。B16F1荷瘤小鼠体内实验结果表明WNV-poly(A)溶瘤作用涉及重塑免疫微环境并诱导CD8+T细胞介导的肿瘤抗原特异性免疫。CDX体内药效实验显示静脉注射WNV-poly(A)可达到瘤内注射相当的治疗效果。HDST/PDX实验结果表明WNV-poly(A)对多种患者来源的肿瘤具有杀伤作用。综上所述，WNV-poly(A)是一种安全有效广谱的新型溶瘤病毒，具有良好的临床转化潜力。 

南昌乐悠生物科技有限公司提供溶瘤病毒HDST/PDX药筛服务，欢迎各种形式合作。有兴趣的请致电：4008-160-580。  

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南昌乐悠生物科技有限公司是一家专业从事肿瘤动物模型构建及抗癌新药临床前药效评价的国家高新技术企业，已经为包括小分子靶向药、大分子靶向药（包括ADC）、溶瘤病毒、细胞药物（TIL、γδT）等多种抗癌新药研发提供了有力的支持，其中部分药物已经进入临床试验申请(IND)阶段。 

REFERENCE：Liu J, Hu YY, Zhang QY, Zhang YN, Li N, Zhang ZR, Zhan SL, Gao L, Deng CL, Li XD, Yuan SP, He YQ, Ye HQ, Zhang B. Attenuated WNV-poly(A) exerts a broad-spectrum oncolytic effect by selective virus replication and CD8+ T cell-dependent immune response. Biomed Pharmacother. 2023 Feb;158:114094. doi: 10.1016/j.biopha.2022.114094. Epub 2022 Dec 8. PMID: 36502755.