Morris水迷宫对慢性应激大鼠空间学习记忆能力的影响

【关键词】：  慢性应激 空间学习和记忆  海马 morris水迷宫

一、材料和方法

1、动物和分组

雄性 Wistar 大鼠 ,体重 180～220 g ,由湖北省医学科学院实验动物中心提供 ,随机分为对照组、应激组、人参皂甙 Rg1 低剂量组和高剂量组 ,每组 10 只。应激组动物给予电击足底加噪声刺激 ,每天上、下午各一次 , 每次 2 h ,共 7 d 。刺激参数为脉冲电压 80v ,持续时间 50 ms ,每 2～25 s 之间随机发生一次。每次电刺激前给予噪音作为条件刺激 ( 80～100 db ,时程 50 ms) 。Rg1 低剂量组和高剂量组处理同应激组 ,但每天上午应激前分别腹腔注射 10 、 50 mg/ kg的人参皂甙 Rg1 。对照组不接受任何处理。

2、Morris 水迷宫

Morris水迷宫由上海欣软信息科技有限公司制作，为一直径 160cm ,高 50cm 的圆桶。划为 4 个象限 ( 按顺时针方向定义为 A 、 B 、 C、 D) ,盛水后按 015 % ～115 %比例加入奶粉 , 使水成不透明乳白色 , 水温控制于 22 ℃～25 ℃。将一直径 11 cm平台固定于第一象限 , 平台在水平面下 1 cm , 用于空间学习和记忆能力观察。第 8 、 9 天 ,3 组动物进行空间觅向训练 ( spatial bias) 。第 8 天训练 9 次 ,每次 2 min ,记录动物从不同象限入水至发现并爬上平台的时间为训练潜伏期 , 每 3 次的均值作为平均训练潜伏期 ,第 9 天重复 6 次训练 ,共得出 5 个平均训练潜伏期 ,作为空间学习能力。第 10 天进行空间定向能力测试 (probe trial) ,先移去平台 ,再将大鼠放入水中 2 min ,记录它在 4 个象限中停留时间的百分比作为空间记忆能力。

3、海马神经元观察

动物在第 10 天行为测定完毕立即断头 ,剥离双侧海马 , 一侧经多聚甲醛固定 ,Nissl 染色 , 冠状切片 ,光镜下 (40 × 10 倍) 观察和计数海马 CA3 区锥体细胞。

4、钙浓度测定

另一侧海马按文献 制备海马突触体。采用Fara 2 2 荧光法测突触体内游离钙。样品用 Fura 2 2 在37 ℃负载 30 min 后 , 脑脊液洗 1 次 , 进行双波长测定。激发波长 A 340 nm ,B380 nm ,发射波长 A 500nm ,B 500 nm ,钙浓度计算公式为 Ca2 += 224 [ ( R -Rmin

/ ( Rmax - R ) ] ( Ff2/ fb2 ) nmol · L- 1。R = F340/F380 ,Rmin 和 Ff2 分别为零时钙荧光比值和 380 nm下的荧光吸收值 ,Rmax和 Fb2 分别为钙饱和时的荧光比值和 380 nm 下的荧光吸收值。

5、统计学分析

所有数据以均数 ±标准差 ( € x ±s ) 表示 , 组间比较采用 t 检验法。

6、结果

    人参皂甙 Rg1 对慢性应激大鼠空间学习记忆能力的影响与对照组比较 , 应激组大鼠在第 8 、 9 天的训练潜伏期明显延长 , 在第 10 天的空间觅向能力训练中 ,动物在四个象限无目的游动 ,花费的时间百分比在四个象限中无明显差异。Rg1 低剂量组除第 5 个平均训练潜伏期较应激组明显缩短外 , 其与应激组无显著差异。Rg1 高剂量组的训练潜伏期和空间觅向时间较应激组均明显缩短。

3 　讨 　论

Morris 水迷宫是一种研究与海马功能直接相关的空间学习记忆模型 , 能较准确地反映动物的空间学习记忆能力。本实验结果显示 , 慢性应激大鼠在 Morris 水迷宫的训练潜伏期明显延长 , 空间定向能力测试时在水迷宫的四个象限中无目的游动 , 提示慢性应激对动物的空间学习和记忆能力有明显损害作用 ,与我们以前的结果相一致。应激前腹腔注射 50 mg/ kg 的人参皂甙 Rg1 ,实验动物的训练潜伏期和空间觅向时间较应激组均明显缩短 , 接近对照组。提示高剂量的人参皂甙 Rg1 对慢性应激大鼠空间学习记忆能力的损害有显著改善作用。实验中发现 ,慢性应激大鼠海马神经元数量减少 ,海马突触体内游离钙浓度显著增高。其原因可能与海马介导空间学习和记忆功能的谷氨酸 ( Glu)能学说有关。海马环路扩要递质系统为 Glu , 海马(特别是 CA3 区) 锥体细胞含有丰富的 N 2 甲基2 D 2 天冬氨基酸 (NMDA) 受体 ,正常情况下 Glu 2 NMDA 受体的激活有助于学习和记忆。但严进等报道 , 慢性应激可导致海马兴奋性氨基酸含量显著增高。过量的 Glu 等兴奋性氨基酸作用于 NMDA 受体 , 受体通道开放 , 大量 Ca2 +内流 , 结果导致胞内 Ca2 +浓度异常增高 ,形成胞内 Ca2 +超载。本实验中发现的海马突触体内游离钙度显著增高与之相一致。胞内Ca2 +超载 , 。高 Ca2 +可激活内源性酶 , 产生大量的自由基 , 毒害细胞可引起细胞坏死 , 也可导致 DNA链的断裂 ,引发细胞凋亡。我们以往的研究也发现慢性应激大鼠海马 NO 含量异常增多。众所周知 , 胞内 Ca2 +浓度增高可激活一氧化氮合酶生成NO ,过量的 NO 及其产生的自由基代谢产物也有神经毒作用。细胞坏死或凋亡的最终结果是海马神经元大量丢失 ,海马容积变小。海马形态结果的变化必然会损害其介导的空间学习记忆功能。

人参皂甙 Rg1 作为一种有效的促智药 , 对多种致呆模型的学习记忆功能有保护作用。本实验结果也表明人参皂甙 Rg1 显著改善慢性应激性空间学习记忆损害 ,同时发现应激引起的海马神经元大量丢失减少 ,海马突触体内的高游离钙浓度显著下降。以有的资料也表明; β 2 淀粉样多肽致呆大鼠 ,人参皂甙 Rg1 能促进海马 CA3 区苔藓纤维芽生。改善 Glu 和海人藻酸对离体脊髓神经元细胞兴奋毒性。降低原代培养大鼠海马神经元过量 Glu 引起的损伤和胞内 Ca2 +浓度的增高。另外 , 人参皂甙 Rg1对多种神经细胞的凋亡有抑制作用。因此本文结果提示人参皂甙 Rg1 对慢性应激性认知障碍产生保护作用可能是通过调节海马细胞内的钙浓度 , 减少海马神经元坏死或凋亡 , 使海马形态结构免受损害而实现。下一步的工作是进行各组动物海马神经内的钙浓度变化及细胞丢失的时程观察。

总结：心理紧张、紧急突发事件和其它应激因素存在时机体产生应激反应。研究发现 , 当人或动物处于强烈的急性应激或长期慢性应激的状态时 ,其学习和记忆能力会受到明显的影响。在中枢神经系统中 , 海马是与学习、记忆和情绪行为功能密切相关的重要脑区 , 也是应激易累及损伤的主要靶区。研究表明 , 慢性应激大鼠海马神经元形态改变和大量丢失 , 同时其介导的空间学习和记忆功能明显下降。人参是祖国传统的中药 ,含有很多有效成分 , 其中人参皂甙 Rg1 的促智作用最好 , 显著改善脑缺血、乙醇和β 2 淀粉样蛋白等引起的学习记忆损害。但人参皂甙 Rg1 对应激性空间学习和记忆功能下降是否有改善作用尚未见报道 , 本实验拟采用电击足底加噪声建立条件性应激模式 , 旨在观察人参皂甙 Rg1 对慢性应激大鼠空间学习记忆能力的影响 , 并初步探讨其作用机制。

来源：上海欣软信息科技有限公司

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