[摘要］ 目的研究甲状腺素、硫辛酸及两药联合治疗对甲状腺功能减退大鼠认知功能损伤的改善，以及血清、海马组织中超氧化物歧化酶( superoxide dismutase，SOD) 、丙二醛( malondialdehyde，MDA) 的变化。方法 成年 SD 雄性大鼠50 只，每组10 只，随机分为5 组，对照组、甲减组［丙硫氧嘧啶( PTU) 组］、左甲状腺素钠( L-T4) 组( PTU + L-T4 组) 、硫辛酸( LA) 组( PTU + LA 组) 、联合用药组( PTU + L-T4 + LA 组) 。8 周后以 Morris 水迷宫试验检测大鼠空间学习记忆能力，采用黄嘌呤氧化酶法测定血清和海马组织 SOD 活力，采用硫代巴比妥酸法测定血清和海马组织MDA 含量。结果 与对照组比较，PTU 组定位航向实验逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) ; 空间探索能力成绩降低，但差异无统计学意义; SOD 活性降低( P ＜ 0． 001) ，MDA 含量升高( P ＜ 0． 001) 。与 PTU 组比较，PTU + L-T4 组、PTU + LA 组、PTU + L-T4 + LA 组大鼠逃避潜伏期均缩短，SOD 活力升高，MDA 含量降低( P ＜0． 05) 。结论 LA 和 L-T4 联合治疗改善氧化应激，显著改善甲状腺功能减退大鼠的认知功能。　　

[关键词］甲状腺功能减退症; 海马; 认知功能; 甲状腺激素　

甲状腺功能减退症( 甲减) ，指血清甲状腺激素水平低于正常范围，是一种常见的内分泌疾病。甲状腺激素不仅在中枢神经系统的发育成熟和功能维持中起重要作用，而且参与高级认知功能。研究发现，甲减可引起认知功能减低、学习记忆能力下降，更被认为是痴呆的一种危险因素。本研究通过抗氧化剂和甲状腺激素联合治疗观察甲减模型大鼠学习记忆能力、空间探索能力的改善，通过氧化应激及抗氧化应激相关指标超氧化物歧化酶( superox-ide dismutase，SOD ) 和 丙 二 醛( malondialdehyde，MDA) 的变化，阐述抗氧化剂对甲状腺功能减退大鼠抗氧化应激能力的改善。　　

1 材料与方法　　

1． 1 动物模型　　

采用成年清洁级 Sprague-Dawley 雄性大鼠 60只( 190 ± 15) g，购自安徽医科大学实验动物中心( 生产许可证号 2011-002) 。饲养环境: 标准鼠笼分笼饲养，每笼 5 只，自由摄食饮水，自然光照，温度( 23 ±2) ℃，相对湿度( 45%～ 50%) 。所有大鼠适应性饲养 7 d 后随机预留 10 只作对照组，正常饮水，其余 50 只纳入实验诱导甲减模型，饮用水中加入含有 0． 05% ( W/V) 丙硫氧嘧啶( propylthiouracil，PTU) ，每周称取大鼠体质量。4 周后，模型组大鼠出现行动迟缓、反应迟钝、饮食饮水量较前减少，体质量增加缓慢，随机选取 10 只，经腹主动脉取血检测甲状腺功能。　　

1． 2 药物干预　　

甲减模型建成后，除对照组外，将 40 只甲减大鼠随机分为 4 组进行干预治疗。包括: 甲减组( PTU组) 、硫辛酸( lipoic acid，LA) 组( PTU + LA 组) 、左甲状腺素钠( levothyroxine sodium，L-T4) 组( PTU +L-T4 组) 、联合用药组( PTU + L-T4 + LA 组) 。每天8∶ 00 PTU + L-T4 + LA 组、PTU + L-T4 组按 0． 02 μg /g L-T4 灌胃，其余各组按等量生理盐水灌胃; 18∶ 00PTU + LA 组和 L-T4 + LA 组按 120 mg / kg LA 灌胃，其余各组按等量生理盐水灌胃。连续 4 周，期间除对照组饮用消毒无菌水外其余各组继续饮用0． 05%( W/V) PTU 水。　　

1． 3 主要试剂和仪器　　

PTU 由上海朝晖药业有限公司生产( 产品批号1205F13) 。LA 由江苏万禾制药有限公司提供 ( 产品批号 110401) 。L-T4 由德国 Merck 公司生产( 产品批号 145574) 。SOD、MDA 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。Morris 水迷宫系统(上海欣软信息科技有限公司提供) 。MultiskanMK3 型酶标仪( 荷兰雷勃公司产品) 。　　

1． 4 行为学检测　　

药物干预 3 周后所有大鼠行 Morris 水迷宫行为学测试，检测大鼠认知及记忆能力。实验期间，室内光照尽量保持一致，迷宫周围物品及空间线索保持固定不变。实验内容包括: ①适应性训练: 实验前3 d每天让动物在无安全平台的水中适应性游泳;②定位航行实验: 实验历时 5 d，每天下午将大鼠面向池壁，分别从 4 个入水点放入水中，记录大鼠在120 s内找到平台的时间 ( 逃避潜伏期 ) ，如果在120 s内未找到平台，潜伏期记为 120 s，由操作者帮助大鼠找到平台，并在平台中央停留 10 s，实验后将大鼠放回笼中; ③空间探索实验: 第 6 天撤去平台，将大鼠由任一入水点下水，记录 120 s 内大鼠穿越平台所在象限的时间、平均速度和总路程及穿越平台所在区域的次数。

1． 5 标本采集与制备　　

各组大鼠按每 100 g 体质量 10% 水合氯醛0． 3 ml 麻醉，仰卧固定在手术板上，常规消毒，腹部正中切口，经腹主动脉取血，普通离心机 3500 r/min离心后取上层血清分为两份，一份于 4℃ 冰箱保存待测三碘甲腺原氨酸( triiodothyronine，T3) 、甲状腺素( thyroxine，T4) 、促甲状腺素( thyrotropin，TSH) ，另一份于 －20℃冰箱保存待测 SOD、MDA。大鼠取血后断头处死，迅速在冰盘上剥去颅骨后，以打孔方式( 15 gauge) 取出海马组织，以 4℃预冷的生理盐水洗去余血，置于液氮中冷冻，保存于 － 80℃ 低温冰箱。检测海马组织相关指标时，取出海马组织，准确称量后按 1∶ 9( W/V) 比例在 0． 9% 生理盐水中匀浆制成 10%海马组织匀浆悬液，用于海马组织 SOD、MDA 的测定。　　

1． 6 甲状腺激素和氧化应激指标检测方法　　

采用化学发光法测定 T3、T4、TSH 水平。采用黄嘌呤氧化酶法测定 SOD 活性，采用硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化产物 MDA 含量。所有实验步骤严格按试剂盒说明书操作。　　

1． 7 统计学处理　　

采用 SPSS 17． 0 进行统计学分析，所有数据以x珋 ± s 表示，大鼠 Morris 水迷宫行为学数据分析采用重复测量设计方差分析，第一次入水成绩及平均成绩比较采用单因素方差分析，其他相关测试指标均采用单因素方差分析和析因设计资料的方差分析。　　

2 结果　　

2． 1 各组大鼠甲状腺激素水平比较　　

与对照组比较，PTU 组、PTU + LA 组 T3、T4 水平明显下降，TSH 水平明显升高( P ＜0． 01) ; PTU +L-T4 组、PTU + LT-4 + LA 组，虽然 T3、T4 均有所降低，TSH 有所升高，但比较无明显统计学意义。与PTU 组比较，PTU + L-T4 组、PTU + L-T4 + LA 组 T3、T4 升高 TSH 降低( P ＜ 0． 05) ; PTU + LA 组与 PTU组比较，差异无统计学意义( 表 1) 。　　

2． 2 各组大鼠 Morris 水迷宫行为学测试成绩比较　　

2． 2． 1 用单因素方差分析比较大鼠定位航向实验成绩　　

2． 2． 1． 1 每日大鼠平均逃避潜伏期比较 与 PTU组比较，PTU + LA 组、PTU + L-T4 + LA 组、PTU +L-T4 组每天平均逃避潜伏期均缩短( P ＜ 0． 05 ) ; 与对照组比较，PTU + LA 及 PTU + L-T4 组逃避潜伏期虽比 PTU 组短，但前 2 d 逃避潜伏期比较有统计学意义( P ＜0． 05) ; PTU + L-T4 + LA 组逃避潜伏期比较无统计学差异( 图 1) 。　　

2． 2． 1． 2 每日大鼠第一次入水逃避潜伏期比较与 PTU 组比较，PTU + LA组、PTU + L-T4 + LA 组、PTU + L-T4 组每天第一次入水逃避潜伏期均缩短，比较均有统计学意义( P ＜ 0． 05) ; 与对照组比较，PTU 组大鼠逃避潜伏期明显延长，比较有统计学意义( P ＜0．05) ; 而 PTU 组、PTU + L-T4 组、PTU + LA +L-T4 组逃避潜伏期略长，但比较均无明显统计学意义。与每日平均潜伏期比较结果基本一致。见图2。　　

2． 2． 2 用重复测量设计的方差分析比较各组大鼠定位航向实验差异 重复测量设计方差分析是目前对 Morris 水迷宫数据分析使用较多的方法，用一般线性模型( general linear model，GLM) 的重复测量过程实现重复测量资料的单变量方差分析，并用多因素方差分析过程实现每个时间点上组间的两两比较，判断大鼠空间学习能力。本研究中，通过球形检验的结果为 P ＞ 0． 01( P = 0． 115) ，不拒绝球形假设，需校正 F 界值( 利用球对称系数对自由度进行校正) 。分析表明，个体内时间差异有统计学意义( F =29． 637，P ＜0． 001) ，逃避潜伏期随时间变化缩短。但时间和分组的交互作用比较差异无统计学意义( F =1． 103，P =0． 357) ，表明时间因素不随分组的不同而改变。组间变异比较有统计学意义( F =100． 637，P ＜ 0． 001) ，表明分组对大鼠逃避潜伏期有作用，5 组间大鼠每次入水逃避潜伏期比较均不同。与 PTU 组比较，药物组大鼠逃避潜伏期均缩短，差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) ，与对照组比较，PTU 组大鼠逃避潜伏期明显延长，比较有统计学意义( P ＜0． 05) ，药物组大鼠虽然逃避潜伏期缩短，但比较无明显统计学意义( 图 2) 。　　

2． 2． 3 各组大鼠空间探索能力比较 各组大鼠在规定时间内评价空间探索实践的强度( 120 s 内穿越原目标所在象限的时间、总路程、平均速度及穿越目标位置的次数、第一次穿越目标所用时间) 。与 PTU组比较，PTU + LA 组、PTU + LT-4 + LA 组、PTU +L-T4 组各项指标均升高，比较有统计学意义 ( P ＜0． 01) ( 表 2) 。　　

2． 3 各组大鼠血清及海马组织 MDA 含量和 SOD活性比较　　

与对照组比较，PTU 组 MDA 含量明显升高( P ＜0． 01) ; PTU + L-T4 组与对照组比较，MDA 含量降低( P ＜ 0． 05) ; PTU + LA 组、PTU + LA + L-T4组分别与对照组比较，MDA 含量差异无统计学意义( 图 3A、B) 。与对照组比较，PTU 组 SOD 活性明显下降( P ＜0． 01) ; PTU + L-T4 组与对照组比较，SOD活性降低，二者差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) ;PTU + LA 组、PTU + LA + L-T4 组分别与对照组比较，SOD 活性差异无统计学意义( 图 3C、D)　　

3 讨论　　

传统观点认为，甲状腺激素( T4) 在人体神经系统生长发育过程中起重要作用。研究表明，甲状腺功能减退引起中枢神经系统功能紊乱，致海马区学习、记忆、注意力、执行功能的受损，严重影响患者生活质量。T4 替代治疗后，在 T4 及 TSH 水平恢复正常时，仍有部分患者持续存在认知功能受损。本课题组前期研究发现，在 PTU 诱导的甲减大鼠模型中，甲减可导致认知功能障碍，L-T4 替代治疗能部分逆转甲减大鼠的认知功能。本研究通过对甲减大鼠进行抗氧化剂 LA 联合 L-T4 替代治疗，观察大鼠认知功能的恢复及与氧化应激相关酶的变化。　　

LA 作为自然界最强的天然抗氧化剂，被称为“万能抗氧化剂”，可增加多种组织( 包括大脑组织) 中的谷胱甘肽和其他内源性抗氧化剂水平，对脑组织神经细胞修复、神经元再生及与脑细胞代谢有一定作用。LA 组单药治疗与 PTU 组相比，对大鼠甲状腺激素无明显作用，但是 LA 联合 L-T4 替代治疗后，大鼠甲状腺功能可基本恢复正常，同时对大鼠行为学检测结果发现，无论 LA 单药治疗抑或联合 L-T4 都可使大鼠记忆能力改善。研究发现，活性氧( ＲOS) 引起的氧化应激损伤是导致多种记忆损伤的关键因素，常用 SOD 活性及其代谢产物MDA 的含量等指标判断氧化应激状态。本研究在对与记忆有密切关系的海马组织氧化应激相关酶学的检测发现，LA 可使海马 SOD 水平升高，MDA下降，通过清除脂质氧化及氧自由基，促进神经元再生，激素替代联合抗氧化剂可使甲减大鼠学习记忆能力提高至正常大鼠基本相当水平，这与 de Chaves等的观点相符。　　

Morris 水迷宫实验是研究空间学习记忆的标准实验，过程包括: 适应性训练、定位航向实验、空间探索能力。对于 Morris 水迷宫实验，国内外的研究较多，通过对大鼠逃避潜伏期的比较探讨各组大鼠学习记忆能力，检测较灵敏，数据误差较小。研究表明，在水迷宫定位航向实验中，大鼠入水象限不同、入水次序不同对大鼠记忆都有影响，因此，选择合适的实验方法及统计方法，对 Morris 水迷宫检测大鼠记忆能力及空间认知功能起重要作用。有学者认为，每天第 1 次定位航行训练的成绩作为评价指标，可以反映出大鼠前 1 d 的记忆力。对大鼠5 d 的训练发现，PTU 组大鼠训练成绩明显较其余 4组差，PTU + LA 组与 PTU + L-T4 组大鼠第一次入水逃避潜伏期有所波动，而 PTU + LT-4 + LA 组大鼠逃避潜伏期持续缩短，这种差异考虑可能与大鼠对周围环境抗应激能力及前 1 d 记忆能力有关，说明联合用药有助于大鼠学习记忆能力恢复。另有学者认为，把每天 4 次训练平均成绩作为评价记忆能力的指标，各组大鼠每天逃避潜伏期均较前 1 d 缩短，PTU 组逃避潜伏期明显较当天其余组大鼠长，PTU +LA 组及 PTU + L-T4 + LA 组大鼠逃避潜伏期与对照组无明显差异，说明抗氧化辅助治疗对大鼠长时记忆能力改善较显著。另有近年较为新兴的重复设计方差分析，动态观察不同组别大鼠在每天不同时间点不同象限的水迷宫逃避潜伏期比较，过程虽复杂，但通过组内及组间比较能较直观地反映逃避潜伏期与时间及时间 × 组别的关系。本研究中所有组别大鼠逃避潜伏期均缩短，各药物组分别与对照组及甲减组比较，个体时间比较有统计学意义，各药物组大鼠学习记忆能力均较 PTU 组强，L-T4 及 LA 单独用药虽能改善记忆能力，但联合用药后有累加作用。说明 LA 可促进海马区神经元修复，改善记忆功能。因此，本研究为目前临床治疗甲退患者辅助使用抗氧化剂提高生活质量提供坚实依据。