1. 操作流程

诱饵基因转化筛库宿主菌Y190―― 含诱饵基因的Y190 保种―― 诱饵基因的

自激活检测―― 筛库(组织库或者小文库)―― 挑选鉴定阳性克隆―― 抽提阳

性克隆中PREY 质粒并在细菌中扩增―― 猎物(Prey)质粒与诱饵(Bait)质粒共

同转化Y190，验证其相互作用

 

2. 方 法

2. 1 诱饵基因转化筛库宿主菌Y190

1） 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜)，OD600 达到1.2 左右。

2） 将此3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD 中培养4 小时左右，使培养液OD600 达到0.6。

3） 50ml 离心管收集菌液(Falcon, BD)，Eppendorf Centrifuge 5810R, 700g (1，865rpm)，5 分钟离心收集菌体，弃上清。

4） 20ml ddH2O 重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。

5） 20ml 1XTE/LiAc*重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R ，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。

6） 根据每个转化需要50μl 菌液的量加入1XTE/LiAc 重悬菌体，分装到Eppendorf 管中，每管50μl 菌液。

7） 每管加约100ng Bait 基因质粒，5μl 预变性的Carrier DNA*，500μl 1XTE/LiAc/PEG*。

8） 放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30 分钟,15 分钟时混匀一次。

9） 30 分钟后，每管加入15μl DMSO(DIMETHYL SULFOXIDE)，轻轻上下颠倒混匀。

10） 42℃水浴热激20 分钟，每10 分钟上下颠倒混匀一次。

11） 冰浴5 分钟。

12） 700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。

13） ddH2O 洗涤一次菌体。

14） 利用残余液体重悬菌体，涂布于SD/-Trp 平板上。

15） 30℃培养箱培养。第2 天即可观察到克隆长出，第3 天克隆即长到所需大

小。

Carrier DNA: Herring Testes Carrier DNA,Denatured. Clontech. 10mg/ml.未使用过的Carrier DNA 先100℃变性10 分钟，立即置于冰浴2 分钟,然后再100℃变性10 分钟，之后置于冰浴上备用。已经使用过的Carrier DNA 只需要100℃变性一次即可。

1XTE/LiAc: V10XTE:V10XLiAc:VH2O=1:1:8

1XTE/LiAc/PEG: V10XTE:V10XLiAc:V50%PEG=1:1:8

50%PEG： 50%为质量体积比。PEG3350 溶于ddH20 中一般需要加热溶解

10XTE： 0.1 M Tris-HCl, 10mM EDTA, pH7.5

10XLiAc： 1M LiAc, pH7.5

2.2 含Bait 基因质粒的Y190 保种

Bait 基因长出克隆后，一般用诱饵基因特异性引物直接在酵母菌落中PCR鉴定是否转入正确的Bait 基因的质粒，然后把经鉴定正确的克隆进行保种。

 

2.2.1 酵母菌落PCR

1) 用含Bait 基因的质粒作为阳性对照，用宿主菌Y190 作为阴性对照

2) 按照下列反应体系进行PCR

ExTaq Premix(Takara) 10μl (2X )

5’Primer 0.5μl (10μM)

3’Primer 0.5μl (10μM)

ddH20 8.9μl菌 0.1μl

3)按照下列反应条件进行PCR

95℃ 5 分钟

94℃ 30 秒

58℃ 30 秒

72℃ 2 分钟

72℃ 5 分钟

72℃延伸2 分钟是针对小于2Kb 的Bait 基因,对于长于2Kb 的Bait 基因要相应延长时间。

4）PCR 产物进行电泳检测

 

2.2.2 阳性克隆保种

1） 将阳性克隆接种到3ml 相应液体培养基中，30℃振荡培养2-3 天。

2） 700g,5 分钟,离心收集菌体。

3） 加入1：1 的液体培养基和Sterile Glycerol Solution*混合溶液。

4） 充分悬浮菌体，放于-80℃保存。

Sterile Glycerol Solution: 65%(V/V) glycerol, 0.1M MgSO4, 0.5mM Tris-HCl, pH7.4

 

2.3 Bait 基因的自激活检测

一般采用膜检的方法，检测LacZ 基因的表达情况。膜检方法如下:

1) 将阳性克隆菌落影印于滤纸上。

2) 将滤纸完全浸于液氮中，时间长于30 秒，取出后晾干。

3) 培养皿加入适量显色液*(新鲜配制)，垫一层滤纸，让其完全湿润，将冻溶后的滤纸铺在上面，使显色液渗透到表层。9cm 培养皿加2ml 显色液，15cm培养皿加5ml 显色液。

4) 盖上皿盖，放置在37℃培养箱中，避光放置。

5) 20 分钟后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录，一般以3 小时为准，特殊情况下可以看过夜是否变蓝。

6)反应过后打开皿盖，将滤纸烘干，保存并记录。

35cycles

显色液: 100ml Z buffer,0.27ml β?mercaptoethanol,1.67ml X-gal

Z buffer: 16.1g/L Na2HPO4?7H20, 5.50g/L NaH2PO4?H2O, 0.75g/L KCl, 0.246g/L

MgSO4?7H2O,pH7.0。室温可以存放一年。

X-gal: X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactopyranoside) 溶于DMF

(N,N-dimethylformamide)中，终浓度为20mg/ml。

 

2.4 诱饵基因筛库

2.4.1 转化法筛选组织库

1) 5-10 个2mm 克隆接种于1ml SD/-Trp 液体培养基中，混匀后转入150ml

SD/-Trp 振荡培养20 小时(过夜)，至 OD600=1.2 左右。

2) 150ml 培养液转入1000ml YPDA(YPD+Adenine)中混匀，此时OD600=0.2~0.3。

3) 培养约4~5 小时至OD600 0.6。

4) 500ml 离心管收集菌液。Beckman Coulter Centrifuge Avanti J-25(以下步骤均使

用此离心机),700g,5 分钟,RT(室温)。同时将2000μl Carrier DNA 预变性两次。

5) 500ml ddH2O 洗涤一次，700g, 5 分钟,RT，收集菌体。

6) 30ml 1X TE/LiAC 洗涤菌体(预先配制50ml 1X TE/LiAC), 转入100ml 离心管。

7) 700g, 5 分钟, RT。(预先配制50ml 1XTE/LiAC/PEG)。

8) 加入12ml 1X TE/LiAc 重悬菌体。

9) 加入100~500μg 文库DNA, 2000μl 预变性的Carrier DNA，轻轻混匀。

10)加入50 ml 1XTE/LiAc/PEG, 剧烈涡旋混匀。

11)30℃孵育45 分钟，每15 分钟混匀一次.

12)加入3.2ml DMSO, 轻轻混匀.

13)42℃热激20 分钟,每10 分钟混匀一次.

14)冰浴5 分钟.

15）700g,5 分钟，收集菌体.

16）加入1000ml YPDA,30℃振荡培养60 分钟.

17）700g, 5 分钟，收集菌体.

18) 加入2ml 0.9％ NaCl 悬浮菌体，终体积约5ml 左右。取20μl 菌液做滴度测定， 其余菌液200μl/ 块， 涂布于15cm SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM3-AT(3-amino-1,2,4-triazole)平板上。第三天起要注意观察平板酵母克隆生长状态。

19) 滴度(转库效率)测定： 20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:10 ；

20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:100；

20μl +180μl NaCl(0.9％)1:1000；

20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:10000

20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:100000

1:1000; 1:10000；1:100000 三种浓度各取100μl 涂布SD/-Trp/-Leu 平板

20) 转库效率的计算：对生长在SD/-Trp/-Leu 平板上的克隆计数，挑选克隆数在30-300 之间稀释度计算转库效率

转库效率计算实例：

.. 在1：10000 转库效率计数平板上长出100 个克隆(稀释度=0.0001)

.. 总悬浮体积= 5ml

.. 文库质粒用量=100μg

转库效率 = = 5 X 105cfu/μg

21)筛库完成，菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT 平板上生长7-14 天后，会有阳性克隆生长出来，阳性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜检(方法见3)。从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey 质粒与Bait 质粒做共转验证。

 

2.4.2 筛选小文库

2.4.2.1 转化法

1)5~10 个2mm 克隆接种于2ml SD/-Trp 液体培养基中，摇20 小时(过夜)，至OD600=1.2 左右。

2) 2ml 培养液转入20ml YPDA 中，此时OD600=0.2~0.3。

克隆数(cfu)X 总悬浮体积

涂板体积X 稀释度X 文库用量(μg)

=cfu/μg DNA

100cfu X (5mlX103μl/ml)

100μl X 0.0001 X 100μg

3) 培养约4~5 小时至OD600 0.6。

4) 用50ml 离心管收集菌液，Eppendorf Centrifuge 5810R(以下步骤均使用此离心机),700g,5 分钟,RT。同时将Carrier DNA 预变性两次。

5)10ml ddH2O 洗涤一次，700g, 5 分钟,RT，收集菌体。

6) 10ml 1X TE/LiAc 洗涤菌体(预先配制1X TE/LiAc)700g, 5 分钟, RT。(预先配

制1XTE/LiAC/PEG)。

7) 加入600μl 1X TE/LiAc 重悬菌体。

8） 加入2μg 小文库DNA，20μl 预变性Carrier DNA，轻轻混匀。

9） 加入2.5 ml 1XTE/LiAc/PEG, 剧烈涡旋混匀。

10) 30℃孵育45 分钟，每15 分钟混匀一次。

11) 加入160μl DMSO, 轻轻混匀。

12) 42℃，热激20 分钟,每10 分钟混匀一次。

13) 冰浴5 分钟。

14) 700g,5 分钟,收集菌体。

15) 加入20mlYPDA,30℃摇60 分钟。

16) 700g,5 分钟，收集菌体。

17) 加入200μl 0.9％NaCl 悬浮菌体,取20μl 菌液做滴度测定，其余菌液涂布于一块15cm SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM 3-AT 平板上。第三天起要注意观察平板酵母克隆生长状态。

18) 滴度测定：方法同筛选组织文库。

19)筛库完成，菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT 平板上生长7-14 天后，会有阳性克隆生长出来。阳性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜检(方法见3)。从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey 质粒与Bait 质粒做共转验证。

 

2.4.2.2 Mating 法

1)将带有小文库基因的质粒分别转入Y187 中(方法见1)，保存甘油菌(方法见2.2)。将甘油菌扩增并保存到96 孔板(Corning Incorporated costar 3599)中，每个孔对应一条小文库基因，-80℃冻存备用。

2) 将Y190 菌液(携带pGB-诱饵基因质粒)平铺在15cm 培养皿中, 用96 孔replicator(sigma)影印到15cm SD/-Trp 平板上。将Y187 菌(携带pACT2-小文库基因质粒)用96 孔replicator 从96 孔板中影印到15cm SD/-Leu 平板上。

3)生长48-72 小时，观察菌落生长情况，每个菌落长至3-5mm，分别印至绒布上。再从绒布上影印到15cm 2xYPD 平板上。Y190 菌(携带PGB-X 诱饵质粒)的

96 个克隆和Y187 菌(携带pACT2-小文库基因质粒)的96 个克隆一一对齐，影印到一起，使其发生Mating。30℃培养20~24 小时。

4)Mating 完成， 再用绒布把菌落从2xYPD 平板影印至SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板上。

5)30℃培养5~14 天，在SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板生长出来的克隆做膜检(方法见3)。

6)对膜检显蓝色的菌落做PCR 鉴定(方法见2.1)是否为对应的小文库基因，并用此基因的prey 质粒与Bait 质粒做共转验证。

 

2.4.3 注意事项

1) 2XYPD 平板培养基应该稍微薄一些，这样培养基比较透明容易观察，可以尽量保证Y 190 菌和Y187 菌克隆对齐。

2) 因为Y190 为Adenine 缺陷菌株，所以菌落为红色。而Y187 非Adenine 缺陷菌株。所以菌落为白色。为了便于操作，一般先把Y187 菌影印到2XYPD平板，然后再影印Y190 菌。

3)Mating 时应该设置阳性对照，以便监测Mating 情况是否良好。

 

2．5． 抽提酵母质粒

1） 膜检变蓝的阳性克隆用牙签涂布在SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板上，约2cm2，然后放置于30℃培养箱中培养3~4 天。

2) 取一Eppendorf 管，加入30μl 5u/μl Lyticase。把菌用牙签刮到lyticase 中，Vortex充分悬浮。37℃孵育30 分钟。

3) 加入170μl Lysis Buffer 使终体积为200μl。再加入200 μ l 玻璃珠

(425-600microns)，200μl 酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，vortex 剧烈振荡5 分钟。

4) 12,000rpm 离心10 分钟，将上清转入一干净Eppfendorf 管中。注意，不要把蛋白转移过去。

5) 加入8μl 10M NH4Ac 和500μl 无水乙醇，混匀，-80℃放置1 小时。

6) 12,000rpm 离心10 分钟，去上清。

7) 加入500μl 70%乙醇洗涤沉淀，12,000rpm 离心5 分钟。

8) 弃上清，真空抽干沉淀。

9) 将沉淀重悬于10μl ddH2O 中，一般取2~3μl 转化大肠杆菌(Escherichia coli)。

Lyticase: 将Lyticase 干粉溶解在1XTE 中，终浓度为5u/μl。

Lysis Buffer: 50mM Tris-HCl(pH8.0), 0.1% Triton X-100 , 0.5% SDS

2.6 酵母质粒的扩增

一般用电转的方法，把从筛库所得的阳性克隆中抽提的Prey 质粒在大肠杆菌中扩增

 

2.6.1 大肠杆菌(Escherichia coli)电转感受态制备

1) 挑一单克隆接入3ml LB 培养基，摇培14~16 小时至 OD600=1.0~1.2

2) 将摇培后的菌液转接1L LB 培养基, 摇培4~5 小时至OD600=0.7-0.8

3) 离心收菌，10ml 冰水溶解

4) 5000g，2oC 离心10 分钟收菌，400ml 冰水将菌重悬，冰浴10 分钟

5) 5000g，2oC 离心10 分钟收菌，40ml 预冷10%甘油重悬，冰浴10 分钟

6) 5000g，2oC 离心10 分钟收菌，加1ml 10%甘油重悬

7) 用枪测量重悬后的菌液体积，加入与菌液等体积的10%甘油(注：等体积10%甘油指重悬后的菌液体积减去1ml。例：加入1ml10%甘油后重悬菌液体积为

4ml，则加入10%甘油量为3ml)

8) 分装到Eppendorf 管中，每管100μl，冰上操作。

9) -80oC 冰箱保存。

10) 取出两管做阴性、阳性对照。

LB：10g/L 蛋白冻,10g/L NaCl；5g/L 酵母提取物。121oC，20 分钟灭菌。

10%甘油：V 甘油：V 水=1：9

 

2.6.2 电 转

1)从-80oC 冰箱取出感受态，至冰上溶解。同时，将电转杯至冰上冷却，打开电转仪准备30 分钟。

2)感受态溶解后，将要转化的质粒(或连接产物或其他要转化的物质)加入感受态，用枪吹打均匀(注意，不要产生气泡)。电转时有必要进行阴性对照、阳性对照，以检验感受态是否被污染及感受态是否正常，有利于在出现问题时寻找原因。

3)将混合后的感受态加入预冷的电转杯(Eppendorf,CAT.No.4307000569)。(注意，不要产生气泡)

4) 擦干电转杯上电极两边的壁。

5) 将电转杯放入电转仪，启动电极。

6) 电击后，用1ml SOC*将感受态洗出，37oC 孵育45 分钟。

7) 6,000rpm，3 分钟离心收菌。

8) 涂板。

不同电转杯的最适电压各不相同，经实验：

1mm 电转杯的最适电压为1900-2200V

4mm 电转杯的最适电压为2300-2500V

8mm 电转杯的最适电压为2500-2700V

SOC: 20g/L 蛋白胨，5g/L 酵母提取物，0.5g/L NaCl，2.5mM KCl，pH7.0。121oC，20 分钟灭菌。冷却至60 oC 以下时，每升加入20ml 灭菌的1M 葡萄糖溶液。该溶液使用前每升加入5ml 灭菌的2M MgCl2。

 

2.7 Prey 质粒与Bait 质粒共转Y190(参考1)

1) 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜)，

OD600 达到1.2 左右。

2) 将这3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数确定)YPD 中培养4 小时左右，使

培养液OD600 0.6。

3) 50ml 离心管收集菌液，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。

4) 20ml ddH2O 重悬菌体，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。

5) 20ml 1XTE/LiAc 重悬菌体，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。

6) 根据每个转化需要50μl 菌液的量加入1XTE/LiAc 重悬菌体，分装到Eppendorf

管中，每管加50μl 菌液。

7) Prey 质粒分别与Bait 质粒和pGB 质粒(无Bait 基因)共转，每种质粒都加入约

300ng；另外再加入5μl 预变性的Carrier DNA，500μl 1XTE/LiAc/PEG。

8) 放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30 分钟,15 分钟时混匀一次。

9) 每管加入15μl DMSO，轻轻上下颠倒混匀

10) 42℃水浴热激20 分钟，每10 分钟上下颠倒混匀一次。

11) 冰浴5 分钟。

12) 700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。

13) ddH2O 洗涤一次菌体。

14) 利用残余液体重悬菌体，涂布于SD/-Trp/-Leu 平板上。

15) 30℃培养箱培养。第2 天即可观察到克隆长出，第3 天克隆即长到所需大小。

16) 用滤纸印大约十几个克隆进行膜检(方法见3)。