1. 用于原核显微注射的DNA的制备:一般是线性化的且经过电泳纯化,凝胶回收,及进一步沉淀纯化,其工作浓度一般为1-5ng/μl。此处DNA的纯度和浓度对后续的成功率影响较大,需谨慎操作。
2. 同步获得供体雌鼠(注射激素的雌鼠与正常雄鼠交配而得)和假孕受体母鼠(正常雌鼠与结扎雄鼠交配产生)。供体鼠用于收集注射用受精卵,而假孕受体母鼠用于孕育注射后存活的受精卵,最后产出F0代转基因小鼠。
3. 供体鼠注射绒毛膜促性腺激素后,采集细胞核清晰的原核受精卵。绒毛膜促性腺激素可使得雌鼠排卵数量是正常排卵数量的2倍。显微注射的受精卵最好于交配后次晨注射前几小时收集,此时易进行注射操作。
4. 用显微注射法将纯化的外源基因注射进受精卵的原核内。工作液中受精卵可能成团状,显微注射用的受精卵必须是单个细胞,而且无细胞碎片。如不符合该标准,需用透明质酸酶进行消化,随后漂洗干净。
5. 受精卵鉴定 ,将存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的输卵管(或子宫)内,饲养后鉴定是否受孕以及个体发育状况。
6. 子代鼠外源基因整合和表达的检测。产出的鼠仔中,属转基因小鼠者,约占全部小鼠的20%-30%。因此,对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。较常用的鉴定基因是否整合的方法有PCR法及Southern杂交法。而Northern杂交,RT-PCR检测,Western杂交,免疫组织化学法则被用来检测转入基因的蛋白表达状况。
7. 转基因小鼠品系的建立。
以上部分,除了涉及到显微注射外,还设计到多项精细操作,如公鼠结扎,母体内分离获得受精卵,受精卵移植等动物实验。步骤繁琐,实验准备细致,同时还需要具备动物生理,解剖知识以及分子生物学原理和操作知识,短时间内很难建立一个稳定高效的平台。