1. 卵子的收集和处理

按本章第二节所述的方法对母兔作超数排卵处理,注射 HCG14 或 18h 后从输卵管内收集卵母细胞,用 0.2% 透明质酸酶除去卵丘细胞,mPBS 洗3次备用。

2. 精子的制备

用假阴道法采精,用于胞质内受精的精子,用 mPBS 离心洗涤 2 次,取 0.5ml 混悬液加入盛有 1ml mPBS 的小管中。以精子悬液一份,加入 3～4份用 PBS配的10% 的 PVP 中,以降低精子运动速度。

3. 精子注射

用注射吸管吸数个精子,注射吸管的内径为7µm(胞质注射用)或10µm(透明带下注射用),按小鼠的精子注射方法,注入到固定吸管固定住的卵母细胞中。

4. 注射卵的体外培养与移植

注射卵经过 mPBS 洗 3 次,移入 TCM-199+10%FCS 的 5OuI 培养小滴中,每个小滴放入5～10 枚注射卵,在二氧化碳培养箱中培养24h后, 如果卵裂即可移植。也可继续培养3～4d，待发育到囊胚,再进行移植。