( 一 ) 供体细胞的准备

以胎儿成纤维细胞为例,其操作步骤如下。

(1) 性成熟雌小鼠(7～8 周龄左右)与雄鼠(8 周龄以上)1:2比例合笼,每天早上观察雌小鼠阴道口,有乳白色或淡黄色胶冻状物(阴道栓)即确定为怀孕,见栓当天为怀孕0.5d。

(2) 怀孕 12.5～14.5d孕鼠,断颈处死,无菌条件下暴露子宫,镊住近子宫段,分离子宫系膜,剪断子宫角,提起整个子宫,在灭菌滤纸上吸干血迹,置人盛有 PBS 或无血清DMEM平皿内。

(3) 沿子宫系膜侧剪开子宫,摘取胚胎,置入另一盛有PBS或无血清 DMEM 平皿内,充分洗涤,去除血迹。

(4) 用小镊子撕破胎膜,取出鼠胚,去除胚胎头部、内脏和四肢,将躯干置入另一盛有 PBS或无血清 DMEM 平皿内,至少洗涤 3 次,完全去除红细胞。

(5)用眼科小剪刀或刮胡子刀片将鼠胚躯干剪(切)成 1mm3以下的碎块 , 吸至离心管内。 

(6)加入等体积膜蛋白酶 -EDTA 消化液,轻轻吹打 3Os。

(7)加入等体积 MEFs 培养液终止膜蛋白酶的消化作用 ,800～1000r/m离心5min,弃上清液。

(8) 加入 5ml 左右的 MEFs 培养液重新悬浮鼠胚组织,移人培养瓶内(每 5个鼠胚可使用1个100-150d培养瓶)让组织悬浮液能均匀覆盖培养瓶表面(培养液不宜过多),培养箱培养条件是 37 ℃、 5%C02 、100% 湿度。

(9) 培养开始却不要晃动培养瓶,第 3 天组织附着培养瓶,表面细胞长出,补充培养液或更换培养液,继续培养。

(10) 第4～5天,细胞连成一片,即可消化制成细胞悬液,置离心管内静置5～10min,取上层液即为单细胞悬液,以 1:3 比例传代,一般采用3～5代作核供体细胞用。达到接触抑制时,再培养 4～7d,并在核移植操作前 3～5d 使培养基中血清降至0.5% 进行饥饿培养,使用时消化成细胞悬液,离心后弃上清,用显微操作液悬浮备用。