一、实验动物精液的冷冻保存技术

动物精液的冷冻保存技术是 20 世纪随着人工授精技术的广泛开展应运而生。世界上一例成功对动物的精液进行冷冻、并且解冻后经人工授精生出动物的是Polge等人 1951年完成的,其研究对象是牛,迄今已有 50 多年的历史。这之后其他动物(实验动物中如猪、兔 等)的冻精也相继研究成功,并且广泛应用于生产和科研。动物精液的冷冻稀释液除其他成分外,低温保护剂是至关重要的。常用的低温保护剂有甘油、二甲基亚砜(DMSO) 等。实验物中以兔的冻精研究较多。 1976 年Weitze等人采用三基--柠檬酸--葡萄糖 -20% 卵黄 -4.5%

DMSM-1% 甘油作为冷冻稀释液,制成颗粒冻精,解冻后移植的受胎率达89.5%细管冻精的受胎率达 84.2%,与鲜精的受胎率无显著差异。我国从 20 世纪 80 年代开展兔冻精的研究，受胎率在 70%～80% 之间。

( 一 ) 动物精液冷冻的基本技术程序

1. 精液的稀释

冷冻前的精液稀释方法有一次稀释法和两次稀释法。

一次稀释法:常用于颗粒精液,近年来也应用于细管、安鼠冷冻精液。即将采出的精液与含有甘油抗冻剂的稀释液一次按稀释比例同温稀释,使每一剂量(颗粒、细管、安瓿)中解冻后所含直线运动精子数达到规定标准,一般每支细管精液含精子1000万,每个颗粒1200 万,每支安瓿含1500万。

二次稀释法:为减少甘油抗冻剂对精子的化学毒害作用,采用二次稀释法效果比较好,常用于细管精液冷冻,也适用于安瓿冷冻。即将采出的精液先用不含甘油的第一液稀释至最终倍数的一半,然后将其稀释后的精液经过1～1.5h,使之温度降到4～5℃时,再用含甘油的第二液在同温下做等量的第二次稀释。

稀释精液前要检查精液品质,其质量优劣与冷冻效果密切相关。精液稀释后,必需取样检测其精子活率,要求不应低于原精液的精子活率。

2. 分装

精液的分装依据精液的冷冻方法,目前有三种类型或剂型。

(1) 颗粒精液将处理好的稀释精液直接进行降温平衡,然后再滴冻成颗粒状。制作简便,利于推广,可充分利用贮藏罐。但有效精子数不易标准化,原因是滴冻时颗粒大小不标准,不易标记,品种或个体之间混淆,精液暴露在外,易污染;大多精液需解冻液解冻。

(2) 安部精液将处理好的稀释精液分装于安部中。制作复杂,冻结、解冻时易爆裂,破损率高;由于体积大,液氮罐利用率低,相对成本增高,但保存效果好,标记好,不易污染。

(3) 细管精液多采用 0.25d、0.5ml的塑料细管。它具有颗粒、安瓿法的优点,对于机械化生产极为方便,多采用自动细管冻精分装装置,装于细管中精液不与外界环境接触,而且 阳管上标记有品种、日期、活率等,易于贮存,冻后效果好。

3. 平衡

将稀释的精液缓慢降温至 4～5 ℃,并在此环境中放置一定时间,以增强精子的耐冻性,这个处理过程叫平衡。

关于平衡的机理至今不很清楚。有关平衡处理的时间也尚不一致。有人认为平衡时间与冷冻速度、稀释液种类、冷冻方法、动物种类等有关。 美国为 6～12h;加拿大为 6～18h;英国为12～18h;前苏联为 3～4h;我国为2～4h 。

4. 精液的冷冻

(1) 颗粒精液冷冻法   将装有液氮的广口保温容器上置一铜纱网或铝饭盒盖,距液氮面1～2cm,预冷数分钟使网面温度保持在-80～-120 ℃。或用聚四氟乙烯凹版(氟板)代替铜纱网,先将其浸入液氮中几分钟后,置于距液氮面 2cm 处。然后将平衡后的精液定量而均匀 l 滴冻,每粒 0.1ml。停留 2～4min 后颗粒颜色变白时,将颗粒置于液氮中,取出 1～2粒解冻,检查精子活率,活率达 0.3 以上者则收集到小瓶或纱布袋中,并做好标记,贮存于液氮罐中存。滴冻时要注意滴管事先预冷,与平衡温度一致;操作要准确迅速,防止精液温度回升,颗粒大小要均匀;每滴完一头公畜精液后,必须更换滴管、氟板等用具。

(2) 细管、安瓿精液冷冻法  与颗粒熏蒸法相同,将冷冻样品平放在距液氮面 2～2.5cm 铜纱网上,冷冻温度为-80～-120 ℃,停留 5～7min, 待精液冻结后,移入液氮中,收集于塑料管或纱布袋中,做好标记,置于液氮罐中保存。工厂化细管精液的冷冻方法是使用控制液氮 量的自动记温速冻器 ,5～-6 ℃每分钟下降 4 ℃ ,-60 ℃后尽快降温至-196 ℃。

5. 精液的解冻

解冻方法直接影响到解冻后精子的活率,这是不可忽视的一个环节。目前,冷冻精液的解冻温度有三种:低温冰水解冻(O～5 ℃)、温水解冻(30～40 ℃)及高温解冻(50～80 ℃)。

不同剂型的冷冻精液,其解冻温度和方法有差别。一般细管、安瓿冷冻精液,可直接肌 38 ℃±2 ℃温水中解冻,颜色一变,即可取出,放在手心中来回搓动; 粒冻精解冻,将装有 lml 解冻液的灭菌试管置于38 ℃±2 ℃的水浴中,当解冻温度与温水温度相同时,投入一颗粒精液,摇动至融化,取出后即可用于输精。

原则上,输精前解冻,解冻后精子活率不低于 0.3,解冻后即输精,一般解冻后最长不超过1～2h。实验证明,解冻后即输精与解冻后4h 后再输精,受胎率由77%降到 51%。

6. 冷冻精液的保存与运输

冷冻精液的保存原则是精液不能脱离液氮,确保其完全浸入液氮中。由于每取用一次精液就会使整个包装的冷冻精液离液氮一次,如取用不当易造成精液品质下降,因而取用精液时一定要注意,不可将精液手提筒超越液氮罐颈部下沿,脱离液氮时间不得超过1Os。保存中还要注意不能使不同品种、个体的精液混杂。

( 二 ) 兔精液的冷冻保存技术

1. 冷冻稀释液的配制

Tris- 卵黄液 (Tris-egg yolk extender) 配制方法如下。

3.028g Tris(C4H11N03)

1.675g 柠檬酸(C6H807H2O)

1.250g 葡萄糖 (C6H1206)

15ml二甲基亚砜 (DMSO)

将上述试剂用蒸馆水溶解,定容至100Oml。向其中加入 200ml卵黄,用柠檬酸调PH值至 6.7。

12% 甘油液:向 100ml 稀释液里加入 12ml甘油,充分混合。

2. 采精与精液检查

按本章第一节所述的方法对公兔采精并进行精液品质的检查(主要检查射精量、精子浓度、活力等)

3. 稀释

将原精液稀释至精子浓度为 30×106个/ml,加入稀释液,稀释 2 倍 (1:2)。

4. 平衡与冷冻

将稀释 2 倍的精液在 5 ℃的冷藏室内放置1～3h;加入与全精液量(2 倍稀释)等量的12%的甘油溶液,混合均匀;甘油的平衡:放置 3Omin;将精液加入保存管(安瓿或细管);立即暴露于液氮的气体中 6～10min, 进行冷冻,然后投入液氮中保存。

冷冻保存法也可以进行颗粒化保存。冷冻时,将平衡后的精液滴加 0.15ml 于挖有小洞的干冰块上进行冷冻。冷冻后放置 lOmin,放入颗粒容器(事先用液氮冷却),保存于液氮中。 

5. 冷冻精液的解冻

冻精使用前要进行解冻。方法如下:

将安前或细管冻精从液氮中取出后,立即放入 40 ℃的热水浴里 40～6Os,使其溶解。颗粒化的冻精移入玻璃容器(离心管),同样进行溶解。

检查活力:活力在 0.3 以上才能进行人工授精。 

( 三 ) 犬精液的冷冻保存技术

1. 精液冷冻稀释液的配置

鲜卵黄     25ml

Tris       2.9Og 

柠檬酸钠   1.85g 

棉籽糖     4.16g 

青霉素 (IU/m1)   1000 链霉素 (mg/ml)   1000 双蒸水     100ml

将上述稀释液按配方配好,一分为二,作为I液和Ⅱ液,在Ⅱ液中添加 4%甘油,置低温冰箱中保存备用。

2. 采精与精液检查

按本章第一节所述的方法采精并进行精液品质的检查(主要检查射精量、精子浓度、活力等)。

3. 精液的稀释、降温与平衡

将采得的精液按 1:1 用I液稀释,分装于灭菌的试管内,加棉塞,然后将试管放入同温度(37 ℃)的烧杯水浴中置于 4 ℃冰箱内平衡。同时将Ⅱ液放入冰箱。约 2h 后检查温度,如达到 4 ℃,则添加 E 液,与 I 液量相同,最终稀释比例为 1:2 。然后在冰箱内平衡 2h。

4. 精液的冷冻

平衡后的精液分装在 0.25ml 的塑料细管和 2mI 的安部中,封口,作标记,利用液氮炸熏法冷冻(细管和安瓶直接投入液氮中)。颗粒冻精即将平衡后精液快速滴入液氮中,每个颗粒的大小约 0.1ml,数分钟后收集贮存于液氮罐内。

5. 冷冻精液的解冻

颗粒冻精的解冻:将恒温水浴箱调到 39 ℃,将试管底部预先浸在水浴内使其温度达到,取一颗冻精放入试管中,轻轻摇动,待其溶解后做常规检查。

细管和安部冻精的解冻:将恒温水浴箱调到 39 ℃,将备好的样品从液氮罐中迅速抽取一支(或一瓶),稍停片刻使其液氮挥发掉,立即放入 39 ℃水浴箱中摇晃几下进行解冻。待完全溶化,将解冻后的细管或安部取出,擦掉管外的水滴后,用剪子剪断两端(安部直接打开盖子),把精液倒入已灭菌的小试管内,准备检查。