1977年,Whittingham首次报道了冷冻保存小鼠 MⅡ期卵母细胞经体外受精移植后产仔。1989年,Nakagata 用玻璃化冷冻保存的小鼠卵母细胞,体外受精后移植,产仔率达 45.8%。20 纪 80 年代以来,人们已对多种动物的成熟卵母细胞进行冷冻保存,解冻后经体外受精获得胚胎进行移植。在实验动物中,兔(Hasani,1988)和猪也都有成功的报道。卵母细胞冷冻 可为体外受精、核移植、转基因动物研制等胚胎工程技术提供更方便和更多的材料来源;卵母细胞冷冻保存与精子和胚胎冷冻保存一起 , 可建立种质资源库,为实验动物保种和珍稀濒危野生动物保护提供新途径。

卵母细胞冷冻保存的方法主要有慢速冷冻法和玻璃化冷冻法。

( 一 ) 慢速冷冻法

 卵母细胞用冷冻保护剂平衡处理,以 1℃/min 的速度降温至 -5～-7 ℃,植冰,然后以0.l～1 ℃ /min 的速度降温至 -30～-40 ℃,投入液氮。以 25 ℃ /min 以上的速度解冻,解冻一般在室温或 37 ℃进行。

  卵母细胞冷冻保存中所用渗透性保护剂为甘油、DMSO。

Im 等 (1997) 比较冷冻 GV 期卵母细胞之前,去除卵丘细胞和保留卵丘细胞对解冻后成目的影响,结果发现,致密的 COC 与裸卵相比具有较高的成熟率,分别为 44% 和 30%。因为卵丘细胞参与卵母细胞成熟,去除卵丘细胞,则降低成熟率。

( 二 ) 玻璃化冷冻法 

玻璃化冷冻法自发明以来便是低温生物学领域的研究热点人们对 Rall 等(1985)的方法进行改进,设计出多种玻璃化冷冻程序,以期望这种简捷快速的冷冻方法能够完全取代复杂 费时的慢速冷冻法。

玻璃化冷冻法要求抗冻保护剂的浓度达到 6.Omol/L 或更高,远远高于传统冷冻法的浓度(1.0～2.Omol/L)。高浓度的玻璃化冷冻液对卵母细胞的化学毒害作用较大。因此,一些玻璃化冷冻法采用低毒性的抗冻保护剂或者多种抗冻保护剂混合使用,以及冷冻前在多种预冷的高浓度溶液中分步平衡等措施来降低玻璃化冷冻液的毒性,从而提高冷冻效率。这些方法是采用 0.25ml 细管作为承载胚胎/卵母细胞和冷冻液的工具,统称为细管法。

另外,提高冷冻效率的途径是加快冷冻与解冻速度。其中有两个方面的好处:一是降低玻璃化冷冻所需抗冻保护剂溶液的浓度;二是降低对低温敏感的细胞结构的冷冻损伤程序。这些方法不使用细管作为承载工具,包括微滴法 (droplets)、电子显微镜铅铜网法(electron microscopic grids,EMG)等。

1. 细管法

在卵母细胞冷冻保存方面,小鼠卵母细胞细管法冷冻保存有一些成功的例子。如 Wood等(1993)用 M2 配制 6.Omol/L DMSO 作为冷冻液(VS)。小鼠卵母细胞在 20℃的 25%VS和65%VS 中两步平衡后,移入 0.25ml 塑料细管内的 VS 液中,在液氮蒸汽中熏蒸 3min 后投入液氮冷冻保存。解冻时细管先进行 lOs 空气浴 (20 ℃ ),然后在 20 ℃水浴中升温 1Os。解凉后卵母细胞的形态正常率最高为77%,体外受精后培养,2 细胞发育率为 91%,移植妊娠率为79%。kono 等(1991)用 VS1( 内含 DMSO、乙酰胺、丙二醇和聚乙烯乙二醇)对小鼠卵母细胞进行冷冻保存, 其方法是:在 25%VS1 和 50%VS1 中分别处理 1Omin 或 100%VS1 中处理1Omin,然后移入小离心管或塑料细管中投入液氮冷冻保存。解冻后正常受精度达 80%～87%,有 69%～78% 发育至囊胚。Wu等(1996)用40%乙二醇和 18% Ficoll 70,以上3:2(V/V)混合后,冷冻保存猪的卵母细胞 , 解冻后形态正常率达97%,但有 70% 的卵母细胞表现线粒体聚合。

2.微滴法

  塑料细管导热性能差,这限制了细管法的冷冻速度最高只能达到2000℃/min。 提高冷冻速度的最简单的方法是不用承载物,将冷冻液和胚胎/卵母细胞直接投入液氮,这便产生了微滴法。在微滴法冷冻过程中,胚胎/卵母细胞在冷冻液中平衡一段时间后,将含有胚胎/卵母细胞的冷冻液小滴(droplet,体积约为 6µl)直接滴入液氮中。然后将冷冻后的颗粒集中到一小管,置液氮罐中保存。解冻程序十分简单,只需将冷冻颗粒直接投入一定温度解冻液中,融化后进行回收和脱毒处理。实验结果表明这种方法的冷冻效率很高。

但是微滴法存在如下缺陷:①冷冻液小滴体积大,小滴在下沉之前漂浮在液氮面上,降低了冷冻速度;②没有承载物,不易进行胚胎/卵母细胞特性标记;③在往液氮中做小滴时容易丢失胚胎/卵母细胞;④冷冻液与液氮的接触面积大,容易造成污染。

因此,Hamawaki 等(1999) 对微滴法进行改进,他们将含有扩张囊胚的冷冻液 (约1µl)滴0.25ml 细管的内壁,封口后直接投入液氮,解冻后胚胎的存活率高达 75.8%。这种方法是微滴法与细管法的结合,其冷冻速度可能略低于微滴法,但是比微滴法安全可靠,且减少污染。时它减少冷冻液的体积,冷冻速度要远远高于细管法,而且没有复杂的装管过程,操作程序 一步简化。

3. 电子显微镜铜网法

Han等 (1995) 证明冷冻速度与溶液的体积密切相关,减少冷冻液的体积能够显著提高冷冻降温速度。基于此,电子显微镜铜网法采用小体积冷冻液(<1µl)和液氮直接接触,并以电子显微镜铜网作为承载胚胎/卵母细胞的工具,冷冻速度达到 3000 ℃/min。具体操作如下:胚胎/卵母细胞在冷冻液中处理一定时间后,将它们和冷冻液移到电子显微镜铜网上,然后用镊子夹住铜网,直接浸入液氮。解冻时,只需将铜网浸没在一定温度的解冻液中,再进行胚胎/卵细胞回收和脱毒。

4. 开放式拉长塑料细管法和玻瑭微细管法

开放式拉长塑料细管法(简称 OPS)。OPS由 0.25ml 细管拉制成,直径为 0.88mm,管壁厚度为0.07mm。实验是在 25～27℃室温中、39 ℃恒温台上操作。冷冻时,将OPS的细小端没入含有胚胎/卵母细胞的冷冻液小滴 (1～2µl)中,利用虹吸效应将胚胎/卵母细胞以及冷冻液装入OPS,然后直接投入液氮保存。解冻时,只要将OPS细端浸入一定温度解冻液,1～2s内冷冻液融化,解冻液进入细管中,胚胎/卵母细胞由于沉降作用离开 OPS管。OPS法的冷冻和解冻速度大于20000 ℃/min,是细管法的 10 倍,而且胚胎/卵母细胞与高浓度抗冻保护剂接触的时间极短 (-180℃以上小于30s,极大地降低了冷冻损伤。另外,与细管法和电子显微镜钢网法相比,OPS 法冷冻、解冻程序大大简化,提高了工作效率。

Kong 等(2000)用玻璃微细管法(GMP法),即以毛细玻璃管拉制成直径为 0.3mm 的玻璃蜘管(GMP)作为冷冻工具,与 Ops 法相比较,冷冻保存小鼠囊胚,结果两者间没有差异。玻墙的导热性能比塑料好,而且GMP的直径小而重量较大,能够克服 OPS 在冷冻时漂浮在液氮

面上的欠缺,冷冻速度要高于OPS。但是在低温长期保持下GMP很脆,容易断裂,造成胚胎/卵母细胞丢失。

上述微滴法、电子显微镜铜网、OPS 法、GMP 法等都使冷冻液和液氮直接接触,这可能造成胚胎/卵母细胞污染。为了解决这一问题,人们设计出几种解决方案。Vajta 等(1998)提出 使用无菌液氮作冷源,胚胎/ 卵母细胞冷冻后进行密封处理,再放入液氮罐中保存。但是这些 操作程序对日常应用而言过于复杂。而 Hamawaki等(1999)将含有胚胎的液滴滴在塑料细管的内壁,加热封口后投入液氮的冷冻方法。此方法可以避免污染问题,但降温速度减慢,操作稍复杂。Vajta等最近报道,利用冷冻的微细管内径和管壁厚度分别小于 400µm和 40µm 时,开口端不必密封,并具有细管法的安全性和 OPS的冷冻速度。这表明只要改进 OPS的内径与管壁厚度,OPS 法将变得既实用又安全。

( 三 ) 小鼠卵母细胞冷冻的技术程序

1. 冷冻培养液

可选择 PBS、PB1 或 M2,调 pH 值为 7.2 或 7.4。

2. 降温

加 0.15ml 培养液于冷冻细管中,将卵母细胞吸入冷冻细管,降温到 0 ℃。10min 后吸入0.15ml 3mol DMSO 。

3. 植冰

15min 后将上述冷冻细管移到 -6 ℃的植冰小皿中,用从液氮中预冷的慑子按常规方法植冰。

4. 冷冻

5min 后移到冷冻的装有液氮的小罐中,以每分钟下降 -0.5 ℃的速度降到-40℃或-70℃,然后投放到液氮中保存。

5. 解冻

取出细管,以每分钟上升 500 ℃的速度速升到 -40 ℃,然后立即放于 40 ℃的热水浴中。取出细管,5min 使降到室温。加 M2 于细管中,混合,以脱去 DMSO。1min 后移到平皿中 , 再用 M2 洗两次。