慢速冷冻和玻璃化冷冻法的解冻方法有所不同。

1. 慢速冷冻法的解冻方法

慢速冷冻法保存的细管,胚胎由液氮中取出并在空气中停留10～15s 后,浸入室温水制37℃水浴中解冻。空气中停留是为了慢速通过胚胎易产生破裂的温度域 (-110～-130℃。由于此方法受冰晶生成的影响,彻底防止细胞破裂的产生有一定的困难。

慢速降温不论是 -25～-35 ℃或 -60℃以下冷冻保存的样本,其细胞内液的浓缩程度均不充分,在解冻升温过程中有冰晶形成现象,这种现象称为脱玻璃化(devitrification)。脱玻璃化的产生对细胞具有致命性的打击。产生脱玻璃化的温度域为 -80～-50 ℃,升温速度越慢越容易产生此种现象。为避免脱玻璃化现象的产生,解冻时必须快速通过这个温度区域。所以细管在空气中停留后,应迅速浸入水浴中升温。

解冻后将细管中的内容物冲出,用 PBS 或其他等渗液稀释 0.5mol/L 庶糖液脱出细胞内部的抗冻保护剂,然后将胚胎移入等渗生理溶液中洗净备用。

回收的胚胎需在显微镜下操作,胚胎需要重新装入一支细管中移植给受体动物。这种操 作有些繁琐,操作过程中容易丢失胚胎。若像冷冻精液一样,解冻后胚胎不出细管直接移植,则在生产中会更实用。所以有研究者在细管内将冷冻保存液和稀释液用空气层隔开,解冻后用力甩动 , 两液混合后进行移植(Leibo,1983),近年来这种方法在生产中得到部分应用(Voelkel et al,1992)。上述方法解冻后不经稀释,抗冻保护剂的脱出是在动物子宫中进行。为此应选用对细胞膜通透性强、化学毒性低的抗冻保护为宜。试验证明,乙二醇要比丙三醇等 其他种类的抗冻保护剂效果好。

另外,慢速冷冻法使用的抗冻保护剂的物质的量浓度较低,对胚胎的化学毒性影响较小，所以解冻后的胚胎在细管中放置数十分钟,对其影响不大。

2. 玻璃化冷冻的解冻方法

玻璃化冷冻保存的样本解冻时间时和慢速冷冻法基本相同,细管在空气中停留10～15s后浸入室温(20～25℃)水浴中解冻(如图5-6-2)。 玻璃化冷冻法由于抗冻保护液的物质的量浓度较高,降温和升温过程中,玻璃化转相温度通过的比较缓和,可彻底防止胚胎的破裂现象发生(kasai et al,1996)。

玻璃化溶液中含有高浓度抗冻保护剂,在液氮中处于超低温状态的情况下,若抗冻保护剂的浓度达不到所要求的程度,在浸入水浴中解冻数秒后可观察到有乳白色(脱玻璃化)现象产生。脱玻璃化使细胞内产生冰晶,直接影响胚胎的存活。为此,在易产生脱玻璃化的温度域(-80～-50℃）应快速升温,对防止脱玻璃化现象的产生非常重要。

玻璃化溶液中抗冻保护剂的含量较高,对细胞的化学毒性影响也较大。解冻后若不经稀释,在室温下放置,短时间内胚胎就会死亡。所以解冻后应尽快将细管中的内容物冲出,并在 0.3～1.Omol/L蔗糖溶液中稀释以脱出细胞内部抗冻保护剂。借助蔗糖溶液的渗透作用,使细胞进一步脱水而收缩,在脱水的同时将细胞内部的抗冻保存剂一同脱出。然后再在等渗的生理溶液(PBS液等)中洗净后供胚胎移植或其他实验使用。