1. 胚胎采集

供体兔每隔12h于颈部皮下注射 FSH 50IU,连续6次。在第72h与公兔交配,配种成功后立即由耳静脉注射 HCG100IU。交配后 6Oh 左右冲取胚胎。用 PBS 洗涤3次,转移到平衡好的含有20%FBS的 M199 液中于 37℃,5%C02培养箱中培养。

2. 溶液配制

0.5mol/L庶糖液 :17.115g 蔗糖 +l00ml PBS+300mgBSA;

FS溶液 :3g 聚蔗糖 +7.02ml PBS,溶解后加 1.71g 蔗糖,完全溶解后加21mgBSA,即为 FS溶液 ;

EFS40 液 : 乙二醇与 FS 溶液按 2:3 体积比混合;

EFS20 液 : 乙二醇与 FS 溶液按 1:4 体积比混合;

BM199 液 :M199 成品粉末按说明书配置,与 FBS 按 4:1 的比例混合,再加入青霉素G0.075mg/L、链霉素 0.01mg/L。

所有配完的溶液使用滤孔孔径为 0.22µm 的滤器过滤。

3. 胚胎冷冻

挑选形态完好的胚胎转入EFS20液中平衡 2min,然后转入EFS40 液中 1min,用 EFS40制作2Oµl的微滴,将10枚左右胚胎转入液滴中。用冷冻管先吸50µl 0.5mol/L 蔗糖液,再依次吸入4ml空气、2ml EFS40液、20µl含胚胎的 EFS40 液、2mlEFS40液、2m10.5mol/L 蔗糖液,然

后两端封口。将冷冻管放到液氮表面平衡 2min 后直接投入液氮中保存。

4. 解冻

取出胚胎冷冻管,快速置于 25 ℃水浴中轻轻摇摆约 10s,待细管中蔗糖溶液段由乳白色变为透明后取出,用吸纸吸去细管表面的水分,剪去细管两端的封口,用吸有1m1 0.5mol/L 蔗糖液的注射器将吸管中的内容物冲入表面皿内,在实体显微镜下回收胚胎,在倒置显微镜下检察冷冻胚胎的成活率。

动物转基因技术是指 : 通过人为的(物理的、化学的或生物学的)方法,将外源 DNA 导入受体的基因组,或敲除受体基因组中的 DNA 片段,使动物的基因型和表现型发生变化,并且这种变化能遗传给后代的一门生物技术。通过这种方法获得的动物称为转基因动物(transgenic animals)。转基因动物的构建基于分子生物学的原理,是在重组DNA技术和胚胎工程技术的基础上发展起来的。重组 DNA 技术使人们可以分离并扩增足够数量的遗传物质 DNA;胚胎工程技术使人们可以将外源 DNA 导人具有发育全能性的早期胚胎细胞或其他细胞。导入的外源DNA在染色体活跃的时期,能整合到受体细胞的基因组中,并且随整个基因组的复制而复制。

1974 年,Jaenisch 和 Mintz 首次报道,通过向小鼠囊胚注入 SV40DNA 后,从发育成的小鼠组织中检测到 SV40 的DNA序列。然而这还不是今天所说的真正意义上的转基因动物,因为用这种方法得到的小鼠只在一部分体细胞中整合了外游、DNA。现在公认的第一只转基因小鼠是 Gordon 等人 1980 年生产出来的,他们采用的方法是向单细胞胚胎的原核注射纯化的DNA( 图 5-7-1)。1982 年,Palmiter 和 Brinster又将重组的大鼠生长激素基因注入小鼠的受精卵原 ,产生了生长速度加快一倍的 " 超级鼠 ", 首次证明了导人基因的性状能在转基因动物中表达。这之后,采用同样的方法,转基因的大鼠(1990,Hochi)、兔(Hammer,1985)、羊(Church,"86)、猪(Hammer,1985) 、牛 (Ward,1986) 等也相继产生。科学家们还相继研究并建立了其他动物转基因的方法。例如 : 逆转录病毒感染法、精子载体法、胚胎干细胞法、体细胞核移植法、人工染色体法、转线粒体法等等。在转基因动物的基础上发展起敲除基因 (Knock-out)技术。Knockout 技术是建立在胚胎干细胞 (ES 细胞 ) 、体细胞核移植和基因打靶技术的基础之上。

20 多年来,转基因动物在生命科学的各个领域得到了广泛的应用。在基础研究领域,研究基因的功能和真核基因的表达与调控,发挥了重要的作用。应用转基因动物技术,培育生长快、耗料低以及提高其他畜产品的产量、提高抗病性,以及生产药用蛋白等方面取得了一系列重大进展。转基因动物应用最广泛的还是生物医学领域。利用遗传工程技术制备动物模型 ,研究疾病的发病机理和治疗方案,是过去依靠自然变异发现和建立动物模型从时间和种类上都无法比拟的。随着人类基因组测序工作的完成,后基因组时代已经来临,人类细胞中30 亿个碱基对,包含有大约 3 万个功能基因,目前已经搞清楚其功能的只不过是冰山的一角,还有 数以万计的基因等待着科学家们测定其功能,许多人类的疾病,正等待着从机理上研究并建立更有效的治疗方案。转基因动物生产药用蛋白和疫苗也将发展成为新兴的制药产业。因此,转基因动物应用的范畴将越来越大,作为生命科学的一个分支被确立下来,并且展示出越来越 广阔的发展前景。