条件性恐惧实验-术后认知功能障碍老年小鼠海马内组蛋白乙酰化含量的变化

来源:上海欣软信息科技公司 发布时间:2015年05月18日 浏览次数: 【字体: 收藏 打印文章

【摘要】目的 观察术后认知功能障碍(POCD)老年小鼠海马内组蛋白乙酰化含量的变化。方法 采用异氟醚麻醉+腹腔探查术建立POCD模型。老年雄性C57BL/6小鼠24只,随机均分为三组:O+二甲基亚砜(DMSO)组(OD组)、异氟醚麻醉+腹腔探查术+DMSO(ID组)及异氟醚麻醉+腹腔探查术+SAHA组(一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,IS组)。麻醉前2h至行为学测试前2h起每天腹腔注射SAHA(50mg/kg)或等容DMSO,连续注射8d。术后第6天行旷场实验和场景性、条件性恐惧实验训练,第7天行场景性、条件性恐惧实验测试。行为学测试后2h,取小鼠海马组织,采用Western blot检测H3、H4、乙酰化-H3、乙酰化-H4、脑原性神经营养因子(BDNF)及caspase-3含量。结果 旷场实验测试中,三组探索路程和中央格停留时间差异无统计学意义。与OD组比较,ID组在场景性恐惧实验测试中的僵直反应明显减少,乙酰化-H3、乙酰化-H4、BDNF含量明显减少及caspase-3含量明显增加(P<0.05);与ID组比较,IS组僵直反应、乙酰化-H3、乙酰化-H4、BD-NF含量明显增加,caspase-3含量明显减少(P<0.05);三组H3、H4含量及条件性恐惧实验测试中僵直反应差异无统计学意义。结论 POCD老年小鼠海马内组蛋白乙酰化含量降低;SAHA可提高组蛋白乙酰化水平,预防老年小鼠发生POCD。

【关键词】术后认知功能障碍;老年小鼠;海马;组蛋白乙酰化

术后认知功能障碍(POCD)是患者手术麻醉后出现的一种中枢神经系统并发症,老龄是其发生的独立危险因素。然而,POCD的发病机制尚不清楚且缺乏有效防治措施。研究表明:阿尔兹海默病等神经退行性疾病的认知功能下降伴随组蛋白乙酰化水平降低,而组蛋白去乙酰化酶抑制剂(SA-HA)可明显增加组蛋白乙酰化水平,进而改善认知功能。本研究观察POCD老年小鼠海马内组蛋白乙酰化水平的变化并探讨其可能机制。

材料与方法

动物选择与分组 老年雄性C57BL/6小鼠24只,16月龄,32~40g(由南京军区总医院比较医学科提供),采用随机数字表法均分为三组:O+二甲基亚砜(DMSO)组(OD组)、异氟醚麻醉+腹腔探查术+DMSO组(ID组)及异氟醚麻醉+腹腔探查术+SAHA组(IS组)。麻醉前2h至行为学测试前2h起每天腹腔注射SAHA(50mg/kg)或等容DMSO,连续注射8d。

POCD模型建立 采用异氟醚麻醉+腹腔探查术建立POCD模型。将ID组和IS组老年小鼠置于透明半封闭呼吸环路麻醉箱中,箱内装有干燥剂和二氧化碳吸附剂。放入箱内前预充1.5%异氟醚+ 100% O(国 药 准 字H20059911,批 号:176715U),维持麻醉25min。待小鼠翻正放射消失后,取右侧卧位,以避免误吸,保持呼吸道通畅。麻醉箱中气体浓度由持续监测多参数麻醉气体监护仪(Vamos ARTJ-0062,德尔格医疗设备上海有限公司)进行连续监测。麻醉手术组小鼠在麻醉后迅速移入预充相同浓度吸入麻醉药及气体的小鼠面罩内进行麻醉及手术。手术前,剪去小鼠腹部毛发,消毒后取腹正中切口约1~1.5cm进行腹腔探查术,按以下顺序依次探查肠道、肝、脾、肾等脏器,手术时间约10min。探查结束后分别用5-0和4-0的无菌丝线缝合肌肉筋膜及皮肤。术后伤口涂抹硫链丝霉素预防感染;皮下注射温生理盐水30ml/kg,补充术中液体丢失;保温处理。术后将小鼠放回笼中,通入100%O,直至意识恢复。预实验血气分析证实小鼠麻醉手术过程中无缺氧、酸中毒等并发症。OD组动物除持续吸入相同时间100%O外不进行任何处理。

    旷场实验 术后第6天行旷场实验。实验采用白色无顶塑料箱(40cm×40cm×40cm),箱底用红线分为9个等份小方格。将小鼠从中央格放入观察箱内,行探索活动5min,由图像自动监视系统(XR-XZ301,上海欣软信息科技有限公司)追踪其探索路程及在中央格停留时间。每次实验结束后用75%酒精擦拭场地,避免前只小鼠残留气味影响实验结果。
 
    场景性条件性恐惧实验 将实验分为训练和测试阶段。旷场实验结束后,进行场景性条件性恐惧实验训练。将小鼠放入实验箱(30cm×30cm×45cm)中适应180s后,接受声音和足底电击刺激(声音,30s,70dB,3 000Hz;电击,2s,0.75mA),继续停留30s后放回饲养笼。训练结束后24h,依次进行场景性条件性恐惧实验测试。场景性恐惧实验测试中,将小鼠放回原实验箱内,不给予任何刺激,记录小鼠5min内僵直反应(除呼吸运动外无其他任何行为活动的状态)时间。场景性恐惧测试后2h,进行改变环境(实验箱底部放入分隔板,四壁粘贴不同形状、颜色塑料板等)的条件性恐惧(无声音,180s;声音,180s,70dB,3 000Hz)测试。测试阶段由图像自动监视系统(XR-XC404,上海欣软信息科技有限公司)追踪小鼠僵直反应时间。每次实验结束后用75%酒精擦拭场地,避免前只小鼠残留气味影响实验结果。
 
    Western blot检测 H3、H4、乙酰化-H3、乙酰化-H4、脑原性神经营养因子(BDNF)及caspase-3行为学测试后2h断头处死小鼠,取海马组织。加入RIPA裂解液,冰上裂解30min。4 ℃约13 000转离心15min,取上清液,Bradford比色法测定蛋白质浓度为1μg/μl,-20℃分装冷冻保存。取相同质量的裂解缓冲液稀释样本,取上样,沸水浴加热5min使蛋白充分变性。冷却至室温后,凝胶电泳分离(浓 缩 胶,80 V,40 min;分 离 胶,100 V,90min)。电转膜仪转膜(100mA,40min),室温下摇动封闭1h。加入一抗4℃过夜,次日摇床漂洗3×5min,加入二抗室温下孵育1h后,漂洗、底物显色反应、显影。采用Image J软件检测H3、H4、乙酰化-H3、乙酰化-H4、脑原性神经营养因子(BDNF)及caspase-3的含量。H3、H4、乙酰化-H3、乙酰化-H4抗 体 购 于 美 国cell signaling公 司;BDNF及caspase-3抗体购于美国abcam公司。羊抗兔IgG-HRP二抗购于美国Santa Cruz公司。
 
统计分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(珚x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Tukey法。
 
结果
 
三组小鼠探索路程和中央格停留时间差异无统计学意义(图1,2)。

与ID组比较,OD组和IS组僵直反应明显增加(P<0.05)(图3)。三组小鼠条件性恐惧实验僵直反应差异无统计学意义(图4)。

 

与ID组比较,OD组和IS组海马内乙酰化-H3和乙酰化-H4含量明显增加(P< 0.05);OD组和IS组之间海马内乙酰化-H3和乙酰化-H4含量差异无统计学意义;三组间H3、H4含量差异无统计学意义(图5)。

与ID组比较,OD组和IS组海马内BDNF含量明显增加及caspase-3含量明显减少(P<0.05);OD和IS组之间海马内BDNF及caspase-3含量差异无统计学意义(图6)。

讨论

本研究结果显示,异氟醚麻醉+腹腔探查术可使老年小鼠场景性恐惧实验过程中僵直反应减少,提示损害海马依赖性记忆;而条件性恐惧实验过程中僵直反应差异无统计学意义,提示不影响老年小鼠海马非依赖性记忆;POCD老年小鼠海马内组蛋白乙酰化含量降低;而SAHA使组蛋白乙酰化水平升高、僵 直 反 应 增 加,说 明SAHA可 明 显 改 善POCD老年小鼠的认知功能。

SAHA是美国FDA批准的第一个应用于临床抗癌治疗的HDAC抑制剂。在阿尔兹海默病等神经退行性疾病动物模型中,急性或长期注射SA-HA可以促进认知相关基因表达,增加组蛋白乙酰化、突触可塑性及长时程增强等,从而改善认知功能。但SAHA对POCD有无改善作用尚不清楚。本研究显示:长期使用HDAC抑制剂SAHA可明显改善POCD老年小鼠认知功能。

阿尔兹海默病小鼠动物模型研究显示:脑内HDAC表达增加,组蛋白乙酰化水平降低,可导致空间记忆损害。本研究与先前研究结果相似,POCD老年小鼠恐惧记忆损害同时伴组蛋白乙酰化水平降低。POCD老年小鼠海马内组蛋白乙酰化含量明显降低,场景性恐惧实验测试过程中僵直反应减少;而长期使用SAHA后,可增加组蛋白乙酰化含量,引起场景性恐惧实验长期记忆测试过程中僵直反应增加,改善POCD小鼠认知功能。这说明组蛋白乙酰化含量下降在POCD老年小鼠恐惧记忆下降中起着重要作用。

我们前期研究证实:SAHA丙戊酸可通过抑制脓毒症小鼠组蛋白去乙酰化酶,增加组蛋白乙酰化含量,抑制其下游炎症反应,神经元损伤等,修复受损神经元,增强突触可塑性,改善认知功能。与此一致,本研究发现SAHA可通过增加海马内组蛋白乙酰化-H3和组蛋白乙酰化-H4含量,从而上调海马内BDNF及下调caspase-3的表达,进而减少神经元损伤,改善认知功能,预防老年小鼠POCD的发生。

总之,本研究表明组蛋白乙酰化水平降低可能参与POCD的发病,使用SAHA可改善POCD老年小鼠的认知功能,其机制可能与增加海马中组蛋白H3、H4乙酰化含量有关。

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