无论用哪一种方法制作转基因动物,对获得的动物都需要进行外源基因的整合和表达水平的检测。在 GFP 等直观的标记基因发明之前,转基因动物的检测主要依赖分子杂交技术。即使是在标记基因使用之后,分子检测仍然是必不可缺的。基因分子检测的基本原理是使用只同目标基因的序列发生结合的探针进行分子杂交,从而探测出外源基因是否已经整合到动物的基因组中。这是初步的整合检测。如果深一步的研究,要了解整合的位点和整合的拷贝,还要进行外源基因的定位和整合拷贝数的测定。接下来,对于经整合检测已经确认的转基因动物,还要进行表达检测。因为并非所有的转基因动物都能表达目的基因的产物,即使有表达,其表达的水平也不尽相同。根据目的基因表达产物的不同,检测的方法也有多种。

( 一 ) 整合检测

1. 采样及提 DNA

用于提取 DNA 供分子检测的动物组织,一般是新生幼仔的耳或尾组织,逐头采样,编好号,剪成小块,置于液氮中,冻结。也可以采血 5O～80µl(小鼠) 放入 DNA 抽提液中。

提取 DNA: 组织样在液氮中磨碎;取 loomg 放人有 1.2ml DNA 抽提液的小管中,50 ℃温育18h,并伴有轻摇。

(1)DNA 提取液

100m mol/L NaCI

10m mol/L Tris · Cl,pH8.0

25m mol/L EDTA,pH8.0

0.5%(w/v)SDS

100µl蛋白酶 K( 临用前加入 2Oµl/ml 贮存液)

不含蛋白酶 K 情况下,DNA 提取液于室温可以长期保存。

(2) 用等体积的酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)抽提样品,重复 2 次,水相为 DNA 溶液(操作过程中需缓慢轻柔)。

(3) 加 2 体积无水乙醇,轻混。

(4) 用 tip 挑出紊状 DNA,并在 75% 乙醇中洗一次,空气干燥 , 然后溶解于含 0.1µmol/ml无 DNA 酶的RNA酶TE中,使 DNA 终浓度约为 1mg/m1,4 ℃保存备用。

而对于希望能获得非常好 Southern 结果的研究就需要下列 DNA 提取方案 :

1)100mg的碎组织样放于1ml提取液中(0.5M EDTA,pH8.0,100µl蛋白酶 K,0.5%十二烷基磺酸钠)。

2)50 ℃水浴 2Oh, 隔时轻轻转动溶液。

3) 用等体积平衡酚缓和抽提3次,离心除酚及界面杂物(酚一般都处于下层)。

4) 将 DNA 液对 100 体积的溶液(5OmM Tris·cl,pH8.0,1OmM EDTA,1OmM NaCI) 透析换液多次,直到透析物 OD270 小于 0.050

5) 用终浓度为 100µg/ml 的无DNA 酶的 RNA 酶 37 ℃处理 3h。

6) 等体积酚氯仿混合液轻抽提2次。

7) 用TE充分透析样品,4℃保存备用。

2.PCR 检测

PCR 检测的特点是快速、灵敏。不同的外源基因,根据 PCR 引物设计的原则,设计并合成一对或数对引物(以便对引物筛选)。先摸索循环反应的最佳条件之后,正式加样进行 PCR扩增,电泳检查,确定阳性的样品。PCR 易出现假阳性,因此需要进一步验证。

3. 斑点杂交 （Dot blot） 和 Southern 印迹杂交

对 PCR 扩增初选出来的阳性样品,还应进一步通过分子杂交来验证。当目的基因与内源基因组 DNA 元同源性时,可用斑点杂交。但如基因拷贝数少或嵌合体时,也会有假阴性。当目的基因与内源基因组 DNA 有较高的同源性时,最好用 Southern 印迹杂交。这是由于在绝大多数情况下原代转基因动物所携带的外源基因以随机方式整合在基因组中,常常会有首尾相连的现象。以 Southern blot 分析便可了解整合方式,从本质上与宿主的基因组同源区分开,而Dot bolt 无法做到这一点。

到目前为止,Southern 印迹杂交仍是公认的最可靠的分子检测方法。进行 Southern 杂交时,底物中应包括未曾酶解的大分子 DNA 和至少两种限制性内切核酸酶消化的 DNA 样本,只有三种样本都给出合理的结果,才能确认目标基因确实已整合到基因组中。

4. 外源基因的定位一一染色体原位杂交

对确认的转基因动物,为了研究整合位点与表型性状、表达量之间的关系,需通过染色体的原位杂交,确定外源基因整合的位点。

邓辉南等人建立的转基因动物染色体原位杂交技术操作如下。

(1) 染色体的制备。以无菌手术采转基因动物耳静脉血,放入盛有肝素(1000u/ml) 的到水瓶中,摇匀,4 ℃静置,使红细胞沉降。取上层血浆层 0.5ml 接种于含有 PHA、青霉素、链霉素和20%胎牛血清的 RPMⅠ1640 5ml中。37℃培养6h后,加100µg/ml5'Brdu,继续培养 12h。细胞经洗涤后,重新悬浮在新鲜的含有2.5µg/m1 胸腺嘧啶的培养基中,37 ℃再培养 6h。收获前知闻

加入秋水仙素 0.04µg/ml。按常规方法制备外周血淋巴细胞染色体玻片标本。置 4℃备用。

(2) 探针标记。对外源基因进行酶切,选取适当的片段(也可用全基因),将 Dig-11-dUTP用随机引物法进行探针标记,也可用同位素标记制备探针。

(3) 变性与杂交。首先对染色体玻片标本进行预处理,每张玻片加 100µl RNA 酶 (100µg/ml),盖上盖玻片,置于潮湿皿中,37 ℃,1h;去除盖玻片,用 2 × SSC 洗片 5 次 SSC：NaCl(3mol/L)+ 高温灭菌柠檬酸钠(pH7.0,0.3mol/L)的混合溶液。再用乙醇(70% 、80%、90%、100%)逐级脱水,空气干燥。然后探针与染色体共变性杂交: 在每张玻片上加杂交液 (1ng/µl 标记探针,50% 甲酰胺,10% 硫酸葡萄糖,0.5mg/ml 硅鱼精子 DNA,2 × SS)100µl,盖上盖玻片,72℃变性 lOmin,迅速置于碎冰上;将共变性的玻片置于潮湿皿中,42 ℃杂交16h。最后进行脱水处理: 杂交反应的玻片用 50% 甲酰胺,2 × SSC 洗涤 5 次,每次 5min。

(4) 基因定位。将洗涤过的杂交玻片标本在 PBS 中洗一次,去除多余的 PBS,但不使玻片完全干燥。在玻片上加 1Oµl胶体金标记的抗 Dig 抗体,盖上盖玻片,室温下反应30min。用 PBS 洗涤一次,然后每次用 200ml 去离子水洗 5 次,以去除氯离子。在每张玻片上加新配制的银增加试剂 100µ1,在潮湿皿中,室温避光作用 3Omin。用去离子水洗涤数次以终止反应。

(5) 染色体 G- 显带。用荧光 -Giemsa 则法进行染色体显带 : 在玻片上加5µg/ml Hoechst33258,室温避光作用 30min,2 × SSC 洗涤 3 次,紫外灯照射 6Omin,用去离子水洗涤就此 10%Giemsa 染色剂 (用 0.06mol/L PB,pH6.8 稀释)染色10min;用去离子水洗去多余的染色剂,自然干燥后镜检。

(6) 镜检与分析。泊镜下选择染色体数目完整、带型清楚的中期相进行分析。只计数与染色体接触的银颗粒。最后进行统计分析,确定外源基因的整合位点。

5. 外源基因整合拷贝数的测定

测定外源基因整合的拷贝数,对于转基因动物整合机理和遗传规律的研究,以及整合拷贝数与表型性状表达关系的研究,具有重要意义。湖北省农科院动物胚胎工程及分子育种实验 室所建立的技术操作如下。

(1) 探针制备及标记。酶切外源基因,取特异片段做探针,用随机引物法进行同位素标记。 

(2) 组织样 DNA 提取。

(3) 标准及待测样品系列制备。用 Dig-DNA 标记检测盒中的 PBR326 标准 DNA(200µg/ml)稀释成不同浓度的标准系列,所含 DNA 浓度从低到高依次为（pg/µl）:0.1,0.5,1.0,10, 20,30,40,50,60,100;取标准 DNA, 待测样品 DNA, 阴性对照非转基因动物 DNA 各 3×6µl,置于 0.5ml的 EP 管中,将各管置于95～100℃水浴中变性 10min 后,迅速置于冰水中;变性之后,各管加 3×4µl SSC,3×6µl TE混合;将准备好的纤维素膜装入加样品,点样,每个点样孔加入 DNA 溶液 15µl,每个样品重复 3 次;点样后抽真空,取出纤维素膜80℃烘干 2h。

(4) 杂交。将预杂交液预杂交6h,加入同位素标记好的探针,于65 ℃摇床中杂交 24h;再用纤维素膜,先用洗膜液 1(2 × SSC,0.1SDS) 洗 2 次,每次 5mn;再用洗膜液 2(0.5 × SSC, 0.1%SDS) 在60℃下洗 2 次,每次15min;洗脱后的杂交膜晾干,按标记部位将各样品点剪下,分别装入标好号的液体闪烁记数杯中。

(5) 消化。纤维素膜装好后立即向杯内各加入60%高氯酸(HC104)300µl,30% 过氧化氢(H2O2)600µl,异丙醇1滴,加盖,置于7O～80℃的恒温培养器中消化1～2h。

(6) 样品放射性测量。利用FJ-2101G 型双道液体闪光计数器进行。消化后的样品加10ml闪烁液 (PP0 6g),二甲苯 670µl,Tritonx 100～300µl,置避光处暗适应 8～1Oh 以减少因化学发光而引起的计数误差, 然后上机进行测量。

 （7）拷贝数分析。按如下公式进行：

式中，N---每个细胞所含外源基因拷贝数；

     nc---待测样品所含细胞数；

     Nc---液体闪烁计数度（CMP）

( 二 ) 表达检测

1. 转录水平（RNA）的检测

一般而言,转基因动物转录水平的检测不主张开腹取样,对于一些在特异器官或组织表达基因,开腹取样会严重影响动物的健康。而浅表组织表达检测采样是可行的。进行 RNA 水平上的检验 ,Northern blot 对同源性较小的外源基因是首选方法;而对于同源性较高的外源基因,转录水平的检测可以参考用 RT-PCR 法。Northern 杂交的底物是RNA,与探针进行 RNA/DNA 杂交。底物可以是从不同组织提取的总 RNA,也可以是经过纯化的总的 mRNA 。进行Northern 杂交时,需要在抑制RNA酶活性的条件下进行电泳分离和杂交,一般不需要将 RNA酶解成片段。如果 Northern杂交的结果是阳性,也可以反过来佐证已成功地获得了转基因动物。 

2. 翻译水平 ( 蛋白质 ) 的检测

转基因动物的最终目的是获得表达产物,所以翻译水平的检测结果是转基因动物构建是成功的关键指标。表达产物检测就是检查目标基因编码的蛋白质,大致需要分四步进行。

第一步,要从表达基因的靶组织提取总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,观察有无分子质量与目标产品相同的新蛋白质条带出现。如果已知产品表达量很低,常规的电泳不易观察到,还要用放射性同位素标记新合成的蛋白质,电泳后转移到感光膜上观察基因表达情况。

第二步,如果看到了分子质量与目标产品相同的新蛋白质条带 , 就要对它进行定性研究,方法是进行 Western blot, 将凝胶上所有蛋白质条带转移到杂交膜上,用目标产品的特异揣 进行杂交。也可以用 EUSA 的方法来检测,它的原理也是抗原/抗体亲和性测定。

第三步,如果目标产品已被确定,要进一步对它的末端氨基酸排列进行测定,看一看是否与天然蛋白质相同 。

第四步,如果产品的生物活性决定着产品的价值,要对产品进行生物活性测定。产品生物活性测定,则要根据蛋白质的种类选择不同的测定方法。