摘要： 自20世纪20年代以来铝盐佐剂如（铝制剂）由于其有免疫增强和安全使用被应用于多种疫苗。然而，这些矿物剂如何影响疫苗的免疫反应仍然是难以捉摸的。对这些佐剂的作用形式存在很多的假设，如仓库的形成，抗原靶向和炎症的诱导。这些假设是基于大龄的体外研究和小量的体内研究。了解体内佐剂与细胞的相互作用对充分了解这些佐剂的作用机制是非常关键的。有趣的是，铝制剂石如何在细胞和分子水平上影响靶细胞，以及由此产生的先天和适应性反应，对合理设计许多疾病的有效疫苗是至关重要的。因此，在这篇评论中，将从体内和体外来探讨铝制剂的作用机制。

 

 

 

自Edward Jenne后，疫苗已经彻底改变了全球公众健康，成功地从传染性疾病中如白喉、B型流感嗜血杆菌（Hib）、乙型肝炎病毒感染、破伤风、 麻疹、流行性腮腺炎、新生儿破伤风、百日咳、肺炎链球菌感染、风疹、和C群脑膜炎球菌感染中挽救了数以万计的生命。自世界卫生组织（卫生组织）宣布彻底控制和消灭天花已经有大约30年。随着疫苗接种率的提高，小儿麻痹症的根除也几乎完成。除尼日利亚，巴基斯坦和阿富汗的脊髓灰质炎流行国家，自1988，脊髓灰质炎病例数减少99%。因此，疫苗的发现已经成为生物医学科学研究的一个最伟大的成就和最安全的干预措施之一。

 

虽然疫苗是最成功的科学突破之一，基础免疫学需要进一步研究。疫苗的成功取决于接种后产生的获得性免疫反应的质量、数量和持续时间。启动获得性免疫应答，许多信号都需要通过未成熟T细胞。在这些信号中，信号1是疫苗衍生的，信号1是疫苗、多肽抗原（Ag）绑定到抗原递呈细胞（APCS）表面的主要组织相容性复合体（MHC）II类和I类。信号2是也被称为"共同刺激"，更重要的是，连同信号1，诱导免疫应答。信号2包括交联CD28和其他T细胞受体通过共刺激分子B7-1（CD80），B7-2（CD86）和其他通过APC表达的配体。信号3是由细胞因子提供，从APC上转运到T细胞，决定T细胞分化为效应细胞。信号2，信号3是由激活的和成熟的APCS如树突状细胞（DCs）呈递给T细胞。成熟的树突状细胞能够诱导细胞的克隆扩增和原免疫反应，从而对疫苗的理解非常重要。

 

树突细胞当从环境中接受特定的刺激时，会发育成熟。如暴露于Toll样受体（TLR）的配体，坏死，炎症性因子（细胞因子），T细胞的配体（如CD40配体），和同型树突细胞间接触中断。树突细胞的成熟包括其表型和位置的变化，将其从一个监控细胞转化为有潜在激活初始T细胞。DC成熟的特点是树枝状突起的外观，增加表达MHCII类分子、共刺激分子、趋化因子受体7（CCR7）和细胞因子。在这样的情形下， MHCII类分子呈递抗原、共刺激分子有助于激活的T细胞，CCR7表达的趋化因子受体介导的细胞迁移到引流淋巴结。细胞因子参与了多种功能，如疫苗注射部位局部淋巴结细胞的运输，T细胞的活化和T细胞分化。

 

在淋巴结中，树突状细胞位于由受体配体趋化因子诱导EB病毒的T细胞进入位点。趋化因子配体9（趋化因子）和次级淋巴组织趋化因子（SLC）或CCL21能增强DC-T细胞吸引力。在淋巴结的副皮质区，B细胞用表面免疫球蛋白结合抗原，成为激活状态。结果，他们迅速在血浆中细胞中分化，并产生低亲和力抗体（Ab）在副皮质区DC-T细胞相互作用导致的抗原特异性CD4 + T细胞的活化，增殖，和分化为T辅助细胞（Th）1，2，和17，和滤泡辅助性T细胞（TFH）。Th2和Tfh细胞开始生发中心反应，细胞和滤泡DCS（FDCS）提供了强有力的激活信号给B细胞。活性B细胞产生分泌抗原特异性高亲和力的浆细胞。

 

生物医学科学的前沿领域，增加了病原生物学、分子生物学、生物化学、免疫学和生物技术的实践和理论认识。因此，疫苗的研制已从试验和错误为基础的实证研究转向更合理和还原论方法。然而，这些方法已经取得了有限的成功，对新兴疾病开发有效的疫苗，如人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征（艾滋病毒/艾滋病）和重新出现的疾病，如结核病和疟疾。这可能是由于一些因素，如身体迅速清除，免疫系统的不识别，没有充分的刺激适当的免疫细胞。因此，合适和安全的抗原发现成为疫苗接种学的主要目标，近年，佐剂的发展共同了抗原的免疫原性，也获得同等的重视。佐剂的使用降低疫苗的剂量，诱导特定的保护性反应(CD4 或 CD8 、 Th1 或 Th2)。为加强广泛的免疫反应，提示佐剂疫苗的设计和开发是非常必要的。因此，设计一种有效的佐剂是疫苗研制的关键。

 

虽然有大量开发的新型佐剂，铝制剂佐剂在所有目前世界批准和许可的佐剂中占主导地位。这种佐剂由Alexander T. Glenny首次使用，准备硫酸钾铝或铝制剂佐剂与白喉类毒素（DT）疫苗共沉淀溶解于碳酸盐缓冲液。由于生产上的可重复性，铝制剂沉淀的技术已被可吸附到预制的氧化铝或铝胶、磷酸铝（AP）或调节磷酸凝胶技术所取代。铝化合物，如氯化铝、硅酸铝、algammulin，铯矾（CA），在实验中被氢氧化铝佐剂取代。虽然这些化合物常被统称为"铝制剂，铝制剂其实是一个独特的化学成分。更重要的是，这些化合物已经被用来强调在体内诱导的免疫反应它们发挥的比较作用。

 

虽然这些佐剂疫苗已在人类有约90年的连续使用，他们的行动机制仍然是难以捉摸的。一些铝制剂引起的影响可能有助于提高疫苗的免疫原性，但是，在许多情况下，这些影响只是部分描述或缺乏明确的因果关联与辅助功能。

 

 

佐剂生物学家假设：佐剂是按照仓库的形成、靶向抗原和炎症来发挥作用。这些假设是基于体外研究和少量的体内验证试验。虽然有不断更新的知识和免疫的过程的理解，但是我们对疫苗佐剂的研究还是大部分靠经验。还原论的方法，如分析体外主要免疫系统细胞的佐剂作用，将有助于确定佐剂的特征对确定其功能是至关重要的，大大提高我们对所涉机制的理解。然而，在体内，在免疫学，生理学和解剖学层面上佐剂及其环境有复杂的相互作用。体外在不同的实验条件下，单个细胞可以表现出不同的行为。因此，了解在体内细胞是如何表现，及他们与环境的相互作用将是我们理解佐剂作用方式的关键。已发表的评论中有关于铝制剂的作用机制的。然而，在体外和体内的数据从未得到完全的比较和评价。因此，本综述是比较体外和体内佐剂的作用模式。

 

 

仓库模式假设最早由Glenny, Buttle 和 Stevens在1931年，在进行白喉和铝制剂共沉淀后提出的佐剂作用模式。他们从豚鼠上切除了一部分给药后3天的注射部位（白喉-铝制剂沉淀或可溶性白喉毒素）。他们将皮肤研磨成乳液，给未免疫的豚鼠注射。白喉-铝制剂沉淀动物免疫成功而接受白喉毒素的对照组没有获得免疫，通过测定抗毒素效价。这个实验使他们产生一种假设：从单一的注射部位铝制剂沉淀抗原在很长一段时间缓慢消除，可以提高抗原原发性和继发性的刺激，导致相关抗体滴度的增强。同样，Harrison 证明了这一假设，通过从一只豚鼠的铝制剂结节转移到另一只豚鼠。White和他的同事认为，佐剂的仓库模式造成持续炎症能刺激区域淋巴结内的免疫细胞和诱导生成肉芽肿导致浆细胞产生抗体。随后的研究，对氧化铝凝胶引发肉芽肿内进行2-3的抗原监测。它被证实，佐剂由强大的吸附剂，能确保一段时间内抗原在局部有较高的浓度。这也是进行抗原摄取和激活APCs 样的树突细胞 DCs所必须的。

 

仓库假设理论能在铝制剂与Ag有较高结合的作用基础上做出合理解释。这会导致注射部位的抗原存留，并在体内缓慢地释放。铝佐剂已经被证实即可通过静电作用、配位交换又可通过亲水性-疏水性相互作用和每个结合的相互作用。主要取决于抗原的特性、PH值，离子强度，表面活性剂的性质。作为吸附的结果，可溶性抗原变成颗粒状。

 

因此，与可溶性抗原相比，颗粒有效地同APCs互动从而增强细胞吞噬。。以及通过内化作用，可溶性抗原可能被困由纤维初级粒子形成的大的不规则的聚集体，尺寸（1-10μm）。随着在体外组织培养基中抗原的不断释放，这些主要的颗粒在聚集体中是松散，并很容易降解。在体内也观察到类似方式的释放，因为含铝佐剂迅速螯合和α－羟基羧酸增溶如柠檬酸，乳酸，在间质液中的苹果酸，可被吸收到组织中，最后通过尿液方式排出。随着时间的变化，作为抗原释放、铝制剂的洗脱或间质液。抗原先被吞噬细胞摄取、包裹最后吞噬。紧着发生，从铝制剂聚集体中释放可溶性蛋白被吞噬细胞胞饮。在体内抗原从佐剂表面的洗脱是至关重要的，因为居住在淋巴结中APCS样的树突细胞能能从注射部位捕获抗原。尽管有淋巴结的树突状细胞对抗原进行胞饮和呈递，但不足以引起体内的免疫应答。从注射部位由树突状细胞对抗原进行的第二轮呈递与淋巴结的未成熟T细胞相互作用能诱导产生有效的免疫应答。因此，注射部位树突状细胞对抗原的摄取和淋巴结部位对持续释放抗原的胞吞，对注射部位抗原的呈递都是至关重要的。然而，抗原的保留和其缓慢释放已经证明铝佐剂在体内对增加抗原反应是可有可无的。在这种情况下，通过 卵清蛋白与氢氧化铝的混合使用及磷酸盐处理的氢氧化铝，抗原的吸附和洗脱速率已经被量化（吸附：91%，完全溶于间质液：4小时）。去磷酸化α-酪蛋白（DPAC）混和氢氧化铝（吸附：100%；完全洗脱在间质液：＜6小时）或磷酸盐处理的氢氧化铝(PTAH-B) （吸附：40%，完全溶于间质液：1小时）。考虑到这些体外数据，作者将这些疫苗制剂对小鼠皮下注射，在体内观察到增强的独立的抗体滴度，抗原吸附特性。因此，它表明，强吸附可能是有损疫苗的物理和化学性质。不过，铝制剂和抗原之间的轻微的相互作用是必要的，例如，在铝制剂和炭疽抗原或乙型肝炎病毒之间相互作用后能观察到一个良好的免疫反应。铝制剂和抗原之间的相互作用是必要得在其他实验中也得到了证明，单独的抗原或铝制剂注射没有产生免疫反应。尽管在一个类似的实验中获得较高定量的抗体滴度。因此WHO建议大于> 80% 白喉毒素DT和破伤风类毒素（TT）应该被吸附。美国的最低要求是> 75% 的DT和TT 抗原应被吸附在铝佐剂中，没有其他正确的候选佐剂。然而，这些都是，在体外实验，因此，没有弄清在体内发生了什么。

 

抗原保留假说，通过对小鼠皮下免疫用放射性免疫小鼠（14C）标记的TT抗原吸附佐剂方法，未被证实。随后，有研究证实了注射部位的抗原存留和免疫5周后大鼠血清中抗体滴度和2周后抗体的增多。在这个研究中，大鼠注射111In标记的α-酪蛋白(IDCAS)抗原吸附至氢氧化铝（AH）或是IDCAS抗原吸附到磷酸盐处理的氢氧化铝（AP），或是非吸附的IDCAS抗原（磷酸盐处理AP构成）通过皮下途径注射。观察到抗原的保留量按照下列顺序：IDCAS?+?AH?>?IDCAS?+?AP?>?PTAP?=?IDCAS。抗体滴度顺序为PTAP?=?IDCAS?+?AP?>?IDCAS?+?AH>?>?IDCAS。揭示抗原保留量和抗体滴度呈逆相关。这个研究，由de Veer和他的同事总结，铝制剂能降低可溶性抗原进入血管的数量。虽然他们的佐剂活性同抗原的缓慢释放不相关的。因此，在体内，铝制剂在抗体反应中发挥强吸附的分散性、抗原的保留、缓慢释放表明铝制剂佐剂可能存在其他的作用机制。

 

虽然，铝制剂的主要作用是储存效果，导致抗原的持续释放。自20世纪50年代以来，这个作用一直受到质疑。Holt首次对这个贮存效果挑战，观察到铝制剂沉淀注射部位切除后7天或更多天， DT引起的抗体滴度没有变化。

 

最近，利用Eα-绿色荧光蛋白（EαGFP）/YAe系统，Hutchison 和他的同事未能观察到OVA?+?铝制剂活化免疫5天后小鼠的抗原特异性T细胞转移到受体上。当抗原被树突状细胞内化，EαGFP是退化的和Eα肽是通过I型抗体细胞表面的MHC II类抗原决定簇呈递的。MHCII类分子复合物可以有效检测到通过YaeAb对细胞染色因为这个公司这些抗体能有效结合Eα(52-68) 和 I-AbMHCII类抗原决定簇。因此，该YAeAb识别相同的MHC抗原表位的T细胞受体。这个系统通过原位杂交法来抗原和Y-Ae抗体的组合，评估抗原的摄取和消耗。值得注意的是，Hutchison的研究进一步证实了在引流淋巴结中，抗原存在后的缺失和吞噬细胞的呈递作用。值得注意的是：B细胞是呈递Eα的一类吞噬细胞，; MHCII类分子复合物在免疫后6-12h,后cDCs在铝制剂?+?EαGFP免疫12-24h 内呈递这些复合物，后体内的了、引流淋巴结在铝制剂使用48-72小时内树突状细胞呈递抗原。在注射部位消融后2小时猴，B细胞、cDCs, 和 pDCs对抗原摄取和表达没有观察到区别。伴随EαGFP的使用，证明铝制剂佐剂对抗原的存储没有作用。

 

 

Landsteiner解释了铝制剂在抗原缓慢吸收延迟去除的机制。这表明这些佐剂的"颗粒"的性质将有利于巨噬细胞的激活剂后续的吞噬作用。抗原的靶向理论进一步由APCs证明，通过观察注射抗原和磷酸盐处理过的氢氧化铝注射位点的吞噬细胞。这是一个开创性的研究，导致铝制剂佐剂抗原靶向的假说。抗原靶向分为三个不同的阶段：第一阶段包括注射部位细胞的积累；第二阶段包括信号1的诱导和APCs产生信号的成熟。第三个过程包括装载抗原的吞噬细胞转移到引流淋巴结。

 

3.2.1铝制剂能在注射部位促使APC募集，产生趋化因子和细胞因子

 

铝制剂能在注射部位，按照时间依赖性产生各亚群白细胞的免疫募集，如嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，巨噬细胞，单核细胞、树突细胞。本次募集同增强mRNA的表达相关的细胞因子，趋化因子和细胞粘附分子、他们的分泌物相关并能增强补体级联反应。已获得各种的空间和时间的炎症细胞募集数据。对免疫细胞募集的影响可能同铝制剂和抗原的配方及传递路径有关。已经发现，在使用铝制剂或是铝制剂+?TT免疫后淋巴组织中产生巨噬细胞、上皮样细胞淋巴组织，胶原纤维。值得注意的是，用铝制剂免疫后中性粒细胞在6、24、72小时已被证明迁移到注射部位。中性粒细胞转运与巨噬细胞炎性蛋白2表达增加（MIP2）或趋化因子（趋）主配体2（CXCL2）和角质形成细胞的趋化因子（KC）表达有关。通过增强蛋白水解裂解的细胞外基质，使表达增加。使用AH+溶菌酶皮下免疫，能增加中性粒细胞的消耗、抗原特异性T细胞的激活和抗体反应活性。因此这表明，嗜中性粒细胞与树突细胞和巨噬细胞进行抗原竞争，从而干扰抗原的呈递。相反，用抗Ly6G抗体处理中性粒细胞，不能影响AH?+?OVA肌肉免疫后抗体的分型和程度。这些不同的结果可能与疫苗的配方和不同的免疫途径有关。

 

在用铝制剂免疫七天后免疫细胞浸润高峰期，巨噬细胞转移到注射部位的研究已有多年。该转移可能与注射部位高表达的CCL2和四氯化碳有关。人类单核细胞表达的趋化因子的类似模式在体外能同铝制剂反应，在体内也被验证。然而，在几个研究中也报道过关于在铝制剂注射部位巨噬细胞消失的案例。不同的数据可能同不同的免疫途径和佐剂抗原配方有关。重要的是，在铝制剂佐剂活化巨噬细胞的作用已经被质疑因为腹腔注射（ip）铝制剂，巨噬细胞系统消耗不影响抗体反应。甚至在皮下注射铝制剂后能增加抗体反应。

 

同样，在24h内嗜酸性粒细胞增多，并且当用铝制剂免疫后第六天炎症细胞能增多至25%。嗜酸性粒细胞募集可能与肥大细胞释放的白细胞介素（IL）5和组胺，巨噬细胞分泌的不明因素和在二次免疫后嗜酸性粒细胞趋化蛋白分泌（CCL11和CCL24分子）相关。接种后，在注射部位的肥大细胞数减少，可能是由于肥大细胞颗粒化和细胞死亡。尽管事实上，肥大细胞是IL-5、IL-16、粒细胞集落刺激因子（G-CSF），KC，和MIP2，肥大细胞与巨噬细胞诱导分泌的IL-1β、IL-1受体拮抗剂（Ra），IL-6，和嗜酸性粒细胞趋化因子的主要来源。细胞耗竭的研究表明，这些细胞在体内是不需要的铝制剂介导进行反应。CCL11的作用同其受体、CCR3、对小鼠嗜酸性粒细胞表达相比，CCL11是有争议的。已被证实嗜酸性粒细胞在铝制剂免疫后是可有可无的。尽管嗜酸性粒细胞是IL-4因子的主要来源和可能引起B细胞的启动和抗体的生产，但在体内他们的缺席不影响铝制剂佐剂疫苗抗体反应的质量。在注射部位的单核细胞和DC的转移是非常重要的，因为APC的相互作用是先天免疫和适应性免疫反应的接口。单核细胞的转移与中性粒细胞的各种信号有关。炎性单核细胞能分化为树突状细胞表明免疫接种随后发生特异性抗原的免疫应答。已经证实，树突状细胞DCS从接种后1天到7天正在积极招募到注射部位。树突状细胞的消耗几乎完全取消了T细胞的免疫应答和抗体的产生意味着在体内铝制剂介导的增强免疫应答树突状细胞是非常关键的。在这种情形下，CD8α+ DCs的缺失，其他未知的树突状细胞亚群，已经被证实出现在CD4+ 辅助T 细胞启动过程。

 

3.2.2 铝制剂能提高抗原的摄取和呈递

 

报道铝制剂佐剂能增强体内巨噬细胞和人外周血单核细胞和树突细胞的抗原摄取能力，在体外能增强树突细胞的抗原摄取能力。在体外使用EαGFP/Yae系统方法能说明铝制剂增强树突细胞抗原靶向功能。这个系统说明氢氧化铝对细胞内抗原存储有这个影响，能提供一个持续的抗原释放到MHCII分子和延长抗原呈递过程。尽管这些数据在体内实验还没有得到证实。其他因素如树突状细胞摄取铝颗粒的潜在功能和进一步结果仍需评估。体外实验中，巨噬细胞吞噬铝颗粒，进一步细胞破裂。Flach和他的同事也通过类似实验证实：铝制剂能结合树突状细胞脂质膜（有胆固醇和细胞运动依赖性）。随后，脂质排序发生改变，导致不需铝制剂内化，就能增强抗原的转运。在相同的研究中，发现铝颗粒存在于树突状细胞内，显示树突细胞是有效地摄取颗粒的吞噬细胞。体外实验已验证了在体内观察，例如，用组织化学法、电子显微镜、X射线微区分析，和原子吸收分光光度法对皮下注射部位肉芽肿实验能发现铝制剂晶体。他们已经被确认存在于巨噬细胞内。多核巨细胞和MHCII +单核细胞，最可能的是树突细胞， T辅助细胞1细胞株（THP-1）表明这些免疫辅助细胞在体内主动吞噬铝制剂。

 

在体内和体外，观察到MHCII分子抗原呈递细胞对铝制剂的摄取，但是对MHCI类分子抗原呈递细胞的数量了解非常少。

 

3.2.3 铝制剂能增强APC的活化和成熟

 

3.2.4 体内铝制剂有助于APCs细胞摄取抗原并转运至淋巴组织

 

3.2.5 铝制剂能产生默认的Th2反应