摘要： 通过近红外（NIR）飞秒激光脉冲（FS）穿入透明的角膜诱导的非线性多光子吸收能以最小的损伤开展新生血管手术。本文，我们介绍了基于飞秒激光对大鼠角膜新生血管选择性显微外科治疗（体内）方法。通过扫描聚焦的激光脉冲在角膜表面2.2-8.6 J/ cm2。的能量密度范围内，实现连续的组织效应。角膜新生血管最小的可见激光损伤确定的阈值为4.3 J/cm2。激光照射后眼前节的组织学和光学相干断层扫描显示新生血管局部变性，而邻近组织没有非预期的变化。此外，经过5天的飞秒激光照射后观察角膜新生血管减少约30%。因此，飞秒激光是一种很有前途的微创手术工具。

 

 

介绍： 角膜新生血管（CNV）是许多角膜疾病的常见和严重并发症，包括：炎症性疾病，感染性角膜炎，角膜晶状体接触相关性缺氧，碱烧伤，基质性溃疡，角膜缘干细胞缺乏。在基质内，血管生成是一个复杂的多阶段过程，新生的血管从预先存在的血管衍生。进一步产生严重的视觉障碍。增殖角膜血管的初步积极治疗方法是使用糖皮质激素。然而，如果角膜的血管已经建立了较长的一段时间，糖皮质激素治疗是不太有效的。众多的激光治疗方法如光凝引起或吲哚氰绿（ICG）介导光动力疗法（PDT）也被用来去除角膜新生血管CNVs。但是由于有严重的不良反应，如较高的复发率和对周围组织的破坏。飞秒（FS）激光烧蚀材料，同时产生可以忽略不计的热损伤。利用飞秒激光诱导的损伤进一步限制激光光斑的大小和局部消融的深度（L）。自由电子通过多光子吸收占主导地位，在一个较低的能量密度范围内产生诱导光化学效应。在更高的能量密度范围内，对针对性材料表面出现明显的热破坏影响。介绍了使用飞秒激光在体内没有药物的应用情况下，对挪威棕色大鼠角膜新生血管结构的显微具体处理。研究中使用检眼镜辅助显微手术实时监控和采集照射目标的图像。用硝酸银烧灼法模仿疾病情况构建大鼠角膜新生血管模型。飞秒激光辅助显微手术系统使我们能够选择性地照射大鼠眼的角膜新生血管结构。激光手术后，光学相干断层成像（OCT）和术后组织学分析密切检查角膜新生血管结构的破坏。最后，我们观察动物飞秒激光手术后5天内的短期变化，记录角膜新生血管结构的减少。

 

材料和方法：动物：32只成年（200-250 g）棕色挪威鼠被用来评估飞秒激光曝光后的影响。成熟的挪威棕色大鼠饲养在标准的实验室条件下（12小时白光- 12小时暗光交替）。大鼠的平均心率为300到400次/分，呼吸率CPM约100。一个呼吸周期需要约600毫秒，呼吸活动是大鼠体内单一的运动。在30 fps的速度之前，期间和飞秒激光照射后，通过对实时视频的分析对动作进行量化。确定相关统计后，从而保持均匀飞秒脉冲辐照。所有程序，动物接受注射麻醉药舒泰50和隆朋的比例为3:1，剂量为1ml/kg，腹腔注射。实验前，局部麻醉剂盐酸丙美卡因0.5%）应用于眼部肌肉的运动麻醉。为防止角膜干燥，在规则的时间间隔局部应用林格溶液。如果有必要，在45分钟的时间间隔补充麻药（10 - 15%）来维持麻醉。去氧肾上腺素2.5%局部给药刺激瞳孔扩张。

 

诱导角膜新生血管：硝酸银烧灼法诱导的大鼠眼产生角膜新生血管（CNV）。每个测试动物的眼睛烧灼用涂抹棒涂用75%硝酸银和硝酸钾25%对角膜中心部位作用约5秒。伴随着烧灼，角膜表面的上皮细胞和基质细胞层的黄棕色损坏的离散的区域与对照大鼠角膜没有诱导血管生成做对比。腐蚀24 h后，角膜缘血管周围日益增厚而出现水肿，在48小时内，许多短的血管芽从角膜缘血管投射到受伤部位。干预第三天，厚密的血管伸长从角膜四周均匀进入角膜中央。经过七天的诱导，观察这些新生血管的重塑和改造。然而，即使经过10天的干预很少有稳定和成熟的血管可以持续更长的时间。该模型可重复操作血管形成的所有主要步骤。因此，它可以成功地用来模拟疾病的环境。大鼠分为两个亚组。16只诱导角膜新生血管2天的大鼠被选为飞秒激光辅助显微外科治疗和另16只作为对照。所有进行飞秒激光治疗新生血管结构的患者在早期发展阶段开展。在麻醉条件下使用高分辨率的数码相机进行眼前段摄影术记录大鼠角膜术后的变化。

 

飞秒激光显微外科手术系统：介绍了飞秒激光辅助显微手术系统在大鼠角膜新生血管的治疗结构示意图。焦点平面与新生血管周边角膜缘血管平面匹配。没有应用压平光学而聚焦的飞秒激光照射到角膜基质。激光光斑几乎为圆形，直径为7.6μm。该系统包括一个软件控制的激光瞄准系统与XY检流计扫描仪到大鼠角膜预先指定的光学可视化跟踪目标。快速开关的发光二极管（LED）（作为照明源获得的速度为30帧的图像序列。大鼠在麻醉条件下，处于一个电动XYZ转动状态，用于操纵目标，以暴露在每一个激光扫描的组织的新区域。平台倾斜角度（?）范围从45°到60°，飞秒激光方向和角膜血管新生血管成直角结构排列。

 

组织学研究和扫描电镜成像：对大鼠角膜激光进行治疗后开展组织学分析。曝光后，采用二氧化碳窒息法处死动物，，随后开展飞秒激光脉冲照射致病变的组织学分析。大鼠摘除眼球，清洗，于4%甲醛溶液中固定一夜。样品被包埋在冷冻石蜡中24小时，随后该组织在?20°被迅速冻结。在低温情况下，开始角膜切片。切片放置在载玻片中并在空气中自然干燥。切片用苏木精和伊红对其染色。用光学显微镜开展组织病理学检查。为了解决异常血管内皮细胞被破坏，染色切片进行涂上薄薄的一层铂，来测量扫描电子显微图像。使用较低的电子能量（即小于1千伏），以避免任何可能的组织损伤。

 

结果和讨论：角膜新生血管结构去除：借助于锐利度算法在优化的焦平面和偏振片角度上获得挪威棕色大鼠眼的角膜图像。速度大约每秒30帧，我们获得了一系列激光对角膜新生血管结构的损伤。最初，下面的扫描参数，扫描面积150?×?150μM和总的扫描时间约 426毫秒，来确定角膜新生血管的MVL损伤阈值。X轴和Y轴的激光发射约为400，连续激光射击间隔约为7.5μm，接近激光束直径。新生血管结构MVL病灶消融阈值被确定，在高分辨率CCD捕获图像之前和飞秒激光照射后。激光能量密度为2.2～8.6 J/cm2。为了验证MVL的阈值，每个能量重复了四到五次。第一个可见的病变是在能量密度为4.3 J/cm2时发现的，被称为最小的可见激光损伤阈值。新生血管结构在能量密度小于2.2 J/cm2发现无明显损伤。当设定的激光能量密度大于6.5 J/cm2，病变的大小增加使其覆盖了整个扫描区域。目前使用的飞秒曝光，激光脉冲持续时间短于电子冷却和复合时间。然而，吸收的时间尺度比的热扩散和冲击波的传播时间更短。这可能会导致局部的光离解作用和激光聚焦附近的基质损伤的后续减少。

 

飞秒激光脉冲被进一步暴露于更大的目标区域，减少更广的区域角膜新生血管。选择用硝酸银烧灼法对大鼠角膜处理后低天用飞秒激光进行治疗。捕获光学图像，标记大鼠角膜内感兴趣的区域。参数包括400?×?400μm扫描区，8.6 J/cm2的能量密度，治疗52?×?52激光斑。连续进行四次扫描，以覆盖更大的表面积。每次激光照射前，手术激光束聚焦（FS）在新生血管结构引导激光辅助对焦。电动XYZ转动阶段是用来操纵大鼠角膜的位置，允许暴露每个激光扫描区域的角膜组织。治疗后，每个扫描点监测~ 3 min观察治疗后的角膜新生血管结构的变化。激光曝光后立即观察到的血液流出。然而，观察3分钟后没有进一步的出血。在大鼠角膜表面或基质除新生血管结构破坏外，没有观测到显著变化或变形。飞秒激光有潜力被用作显微外科工具。对照样品（大鼠角膜没有血管生成）进行治疗和曝光后监测3分钟。无血管结构的角膜基质内观察到飞秒脉冲照射对其没有不良影响。

 

大鼠角膜的术后特征：飞秒激光照射到含有血管结构的角膜基质暴露后，我们用光学相干断层扫描依次拍摄大鼠角膜。OCT，具有高轴向分辨率的组织平面，有评估角膜的潜力。CNVs被清楚地观察到，为角膜基质内的空隙或空白，具有几十微米。飞秒激光脉冲照射曝光后，在角膜基质层观察空隙或空隙明显减少。同时，从对照组大鼠的图像显示没有血管结构的存在。用飞秒激光照射对照组大鼠角膜基质，处理后的角膜的厚度增加，可能是由于大鼠体内的伤口愈合反应。角膜出血，存在在房水中，会使大鼠视力出现模糊不清。在目前的OCT图像中，没有观察到其他的实质性损伤。激光曝光后1天这些出血消失，由于大鼠眼眼前段的吞噬细胞活性。应该指出的是，飞秒激光照射的影响仅限于角膜基质的浅区域因为我们的飞秒激光脉冲聚焦在比较混浊的角膜基质从角膜缘血管周围出现的CNVs。当前飞秒激光外科手术当超快激光聚焦时，通常发生在透明介质没有形成丝状物。光学相干断层扫描图像在底层的角膜基质层和虹膜区域没有显示这样的效果。对大鼠角膜进行组织学评价验证区域内新生血管结构的减少。治疗以及未治疗的大鼠飞秒激光曝光1天后被处死。显示扫描电子显微镜（SEM）、厚度为6μm大鼠角膜切片的显微镜照。飞秒激光辐照后的光学图像显示血管内皮细胞的破坏。在角膜基质内的区域最终出现许多细胞外血细胞。除了在角膜基质存在红细胞和新生血管的结构破坏外，上皮细胞、内皮细胞、虹膜和角膜基质在外观上是正常的。这可以被称为选择性。从目前的组织和OCT的分析结果表明，飞秒激光对新生血管结构的光离解作用选择区域为大鼠角膜。选择性可能来自针对靶组织的不同性质的损伤阈值的差异。由于在新生红细胞的存在近红外飞秒激光脉冲的强线性吸收在穿孔过程中起作用。这些发现同斑马鱼胚胎体内研究各种细胞包括细胞壁、细胞膜的显微手术，甚至细胞器高度一致。

 

飞秒脉冲激光诱导的消融，一般可分为两个方式：（1）强热消融，强度明显高于阈值。（2）温柔的消融，强度接近烧蚀阈值或化学电离。我们采用后者。

 

角膜新生血管结构的减少：术后评估研究飞秒激光照射对角膜新生血管（CNV）减少的影响在的硝酸银烧灼诱导的CNV大鼠模型上开展。四只大鼠连续观察5天。两大鼠眼睛有CNV，一只眼睛是用飞秒激光脉冲照射，而另一个是作为一个对照。有效去除身体反应影响的可能误差。术后短期变化，对大鼠角膜有或无新生血管结构进行连续的光学图像记录分别在飞秒脉冲激光治疗后1、2、5天。在所有的动物，1天完全解决了血管出血。检查大鼠角膜从受伤部位，无角膜感染性角膜炎或炎症性疾病均被记录。没有观察到虹膜形状的变化。此外，血管生成的反应是均匀的，几乎同角膜损伤时一致。观察治疗1天或2天后，新生血管结构明显减少。对照组大鼠角膜当前激光能量密度下的飞秒激光脉冲照射后均无不良影响。应该指出的是，在血管形成硝酸银烧灼模型，血管形成可重复的方式持续7天以上。

 

结论：眼睛角膜新生血管性疾病能产生严重的视觉障碍，是一个重大的公共卫生问题。CNV光疗法已经被报道：这种方法的副作用是对邻近组织热损伤发生率很高。飞秒激光（800 nm）是开展眼部微创手术一个很有前途的工具，通过诱导等离子体介导的非组织消融。

原文见http://link.springer.com/article/10.1007/s10103-014-1545-0