摘要：视网膜脱离（RD）是导致失明的主要原因，虽然通过手术再附着率有很大提高，许多黄斑脱落视觉结果令人失望的，主要原因是感光细胞死亡。以前发现，在啮齿类动物的缺血/再灌注损伤模型中，叶黄素有抗凋亡作用。本研究的目的是调查叶黄素作为手术的一种可能辅助药物。

 

方法：SD大鼠视网膜下注射1.4%透明质酸钠用于诱导视网膜脱落直至脱落约70%。诱导RD后4h内，每日腹腔注射玉米油（对照组）或含0.5mg/kg叶黄素玉米油（治疗组）。在视网膜脱落后第3天和第30天被安乐死，采用TUNEL染色和细胞计数对视网膜切片分析其视网膜外核层（ONL）感光细胞凋亡和细胞存活。通过免疫组化对神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）和视紫红质（Rho）的表达进行分析。用抗激活型Caspase-3、激活型Caspase-8和激活型Caspase-9抗体进行的免疫印迹划定叶黄素在细胞凋亡中的作用机制。为寻求一个可能的治疗时间，相同的一组重复治疗实验在视网膜脱落（RD）后36小时开始。

 

结果：RD后4h 给予叶黄素，与赋形剂组相比，RD后3天视网膜外核层有较少的TUNEL阳性细胞。细胞计数结果显示视网膜叶黄素治疗30天视网膜外核层有明显的核。治疗组也显著减少GFAP免疫反应和保存的Rho激酶的表达。RD后3天，免疫印迹显示治疗组的激活型Caspase-3和激活型Caspase-8表达减少。激活型Caspase-9没明显变化。在RD后36h时给予叶黄素，也观察到类似的结果。

 

结论：研究结果表明，叶黄素是一种有效的神经保护剂，可以补救RD大鼠的感光细胞，至少在视网膜脱落36h内有效。叶黄素可以作为RD病人术后辅助药物，来改善视觉效果。

 

 

介绍：视网膜脱离（RD），定义为视网膜神经上皮层与底层的视网膜色素上皮细胞分离，可造成毁灭性的视觉损失。随着外科技术的进步，复位率大大增加，尤其是多次手术后。然而，最终的视觉效果仍然令人失望，尤其涉及视网膜黄斑脱离。即使全视网膜复位，术后视力长期维持在0.2到0.4的范围内。感光细胞凋亡已被假定为视觉损失的主要原因，除了在视网膜上的其他结构的变化，如神经胶质疤痕。为达到更好的视觉效果，防止或减少感光细胞死亡的神经保护作用也因此成为了研究的重点。

 

叶黄素，类胡萝卜素类色素，通过长期的、大规模的随机、安慰剂对照试验已被证明对降低年龄相关性黄斑变性（AMD）风险有效。Krinsky回顾了叶黄素和玉米黄质对防止眼睛黄斑变性的生物学机制。此后，叶黄素已被作为一种抗氧化剂和抗炎剂的神经保护剂在不同的疾病模型中被研究，包括糖尿病性视网膜病变，葡萄膜炎，视网膜光损伤与缺血/再灌注损伤。叶黄素已被证明，不仅对RPE细胞有效，而且对其他细胞成分包括神经节细胞层，内丛状核，甚至感光细胞有效。叶黄素也被证明有抗氧化功能。它吸收蓝光，包含双键，淬灭活性氧，减少氧化应激。活性氧清除剂和抗氧化剂可能对RD有保护作用。RD，底层的神经视网膜RPE分离剥夺了感光细胞的氧气和营养供应，诱导缺氧环境下活性氧和氧化应激的产生，最终导致感光细胞死亡。叶黄素保护感光细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡。

 

方法：动物和研究设计：选用雄性SD大鼠（200-250g），饲养在温控房间内，大鼠被分层两组，治疗组接受含叶黄素的玉米油和一个赋形剂组接受玉米油。右眼（OD）诱导的视网膜脱离，而左眼（OS）作为对照组。进行四个独立的实验：前两个评价视网膜脱离后4h给予叶黄素的短期和长期的影响.后两个评价视网膜脱离后36h给予叶黄素的短期和长期的影响。

 

视网膜脱落实验模型：大鼠腹腔注射甲苯噻嗪（7 mg/kg）和氯胺酮（70 mg/kg）混合剂麻醉。局部麻醉（1%盐酸丙美卡因）和散瞳剂（1%托吡卡胺）应用到右眼。做一个小的角膜切除术是为了在这个过程中释放眼压。在手术显微镜下观察眼底，凝胶4000应用于眼。大鼠右眼睛巩膜和视网膜上边缘下约2毫米，用30号针头机械性诱导视网膜脱离。通过模拟视网膜裂孔的视网膜切开术，针然后缩回到视网膜下的空间，透明质酸钠被注入直到引起70%的视网膜脱落，模仿孔源性视网膜脱落。手术显微镜下进行检查，并为每一只动物拍摄一张眼底照片。预防性抗生素（妥布霉素软膏）被应用于预防术后感染。动物进行定期监测直到他们恢复意识及进行日常术后护理。

 

治疗：20%叶黄素玉米油悬浮液。治疗组 用纯玉米油将浓度0.5mg/kg叶黄素稀释至0.3mg/ml。赋形剂组给予相当数量的玉米油，所有治疗均给予腹腔内注射。

 

组织收集与处理：在不同的时间点，用过量戊巴比妥钠处死动物。检查眼睛视网膜脱落的高度和用6-0可吸收缝合线被缝合到每只眼的鼻结膜来标记解剖位置。摘除眼球，角膜和晶状体被仔细移除。在4°C，用4%多聚甲醛在磷酸盐缓冲液（PBS， 0.01M，pH 7.4）固定眼球。使用乙醇和氯仿进行一系列脱水，石蜡包埋用切片机切成6μM矢状断面。

 

组织学分析：视网膜切片脱蜡和苏木精-伊红染色（HE）。在三个不同的位置对外核层（ONL）厚度和单位面积细胞计数进行量化。中央（100-150μM距视神经），外周（100-150μM距锯齿缘）和中周（在中枢和外周之间）。每只眼睛随机选择两个有代表性的部分，进行测量和算平均值。仅对视神经盘的视网膜部分进行分析，不脱落的地区被排除在外。

 

TUNEL法：TUNEL法根据说明书对凋亡细胞进行量化。每只眼睛随机选择两个有代表性的部分。同样，视网膜切片选择显示视神经盘部分。在400倍放大倍率下每一个视网膜十四个区域被拍到，几乎覆盖了整个视网膜的长度。切片用DAPI复染，核染色。外核层（ONL）细胞通过TUNEL和DAPI染色计算细胞凋亡数目。每只眼睛细胞凋亡率（TUNEL阳性细胞数÷总ONL区域）。因为它已被证明的最大凋亡发生在视网膜脱离后3天，TUNEL染色仅在试验1和3执行。

 

免疫组织化学：每只眼睛随机选择三个显示视神经盘的视网膜部分。脱蜡视网膜切片浸入抗原修复蛋白酶K溶液和10%山羊血清封闭一小时。然后在4°C同主要抗体孵育过夜：兔抗胶质纤维酸性蛋白，小鼠抗谷氨酰胺合成酶和兔抗视紫红质蛋白。经PBS彻底清洗，放在相应的二抗，室温下1 h后孵育， DAPI复染，再次清洗，荧光显微镜下观察。对视网膜切片进行分级，从1到5，视紫红质GFAP免疫反应强度，5是最强的。

 

Western blot分析：为划定叶黄素发挥其抗凋亡作用的机理途径，免疫印迹法对细胞凋亡过程中几个关键参与者进行分析。先观察激活的caspase-3的活性，在细胞凋亡的最后共同通路中的重要感受器。进一步研究叶黄素参与Fas介导的外在途径和线粒体内途径激活的caspase-8和caspase-9的活性。实验1和3重复进行蛋白质样品的免疫印迹法。实验组和对照组视网膜从玻璃体和视网膜色素上皮剥离，随后在150 ml RIPA裂解缓冲液匀浆。实验眼，附加的视网膜部分手动剥离。样品于4°C， 13500 rpm离心25分钟，吸取上清液。用分光光度计测定每一个样品的蛋白质浓度。用15%的SDS-PAGE凝胶对蛋白质样品进行分离，转移到PVDF膜。含5%脱脂牛奶TBST进行阻断。膜同抗激活型caspase-3 、激活型caspase-8 , 激活型caspase-9、Bcl-2、磷酸化Akt的一抗在4°C孵育过夜。膜也与抗肌动蛋白抗体室温条件下孵育30分钟。对蛋白条带进行检测。

 

结果：视网膜脱落模型：所有脱落的视网膜保持脱落直到安乐死。脱落的百分比（约70%）是通过眼底照片记录的。实验使用的动物数目见表。术后并发症包括轻微的出血，与注射和眼压短暂升高有关。

 

ONL细胞凋亡：TUNEL阳性细胞被发现仅存在于视网膜脱离的部位，通过使用感光细胞核DAPI染色共定位加以确认。实验1中，叶黄素治疗明显减少细胞凋亡的数目，同赋形剂组相比。在实验3中得到了类似的结果，当视网膜脱落后36h开始治疗时。在实验2中，发现叶黄素处理组ONL保留的细胞比赋形剂组明显多。细胞计数结果表明，对侧未分开的视网膜大约每平方毫米有65304±1843个细胞。叶黄素治疗眼剥离的视网膜大约每平方毫米有58202±1054个细胞。赋形剂治疗眼剥离的视网膜大约每平方毫米有49843±1195个细胞。实验4 RD后36小时治疗也发现类似的结果，在ONL叶黄素处理的动物也表现出更明显的细胞存活。

 

视紫红质：实验1和3，无论4小时或36小时，叶黄素治疗在厚度和强度方面与对照组相比导致相对保守的视紫红质（Rho）免疫反应。同样，从实验2和4的结果显示了类似的趋势，在实验4中，由于大的方差无统计学意义。

 

GFAP：GFAP免疫反应主要存在于神经节细胞层（GCL）具有不同程度的扩展到外层视网膜，说明Muller细胞增殖的过程。我们的研究结果表明，在RD后前3天，叶黄素或玉米油治疗对星形胶质细胞活化方面没有产生实质性差异。然而，在实验2和实验4，叶黄素治疗显著降低GFAP免疫反应。Muller细胞长度和厚度在赋形剂组比叶黄素治疗组显著增大，提示星形胶质细胞肥大和增殖。

 

凋亡通路：RD后36h治疗组，激活型caspase-3蛋白水平明显低于对照组。治疗组在RD后4 h表现出相似的结果，虽然减少的趋势无统计学意义。RD后4h 叶黄素治疗组和赋形剂组caspase-8水平存在显著性差异。RD后36 h接受治疗有相似的趋势，但差异无统计学意义。

讨论：抗凋亡作用：细胞凋亡是由多种细胞信号调制，其中半胱天冬酶构成的核心作用。两个主要的信号转导通路的Fas介导线粒体外在和内在途径，最终汇聚形成最终的共同效应途径涉及半胱氨酸蛋白酶3，6和7。这两种途径都参与了RD后感光细胞凋亡。RD感光细胞凋亡的过程，程序性坏死、自噬与炎症过程。

 

Muller细胞的活化和增殖：GFAP，胶质细胞反应性增生的一个标志。RD诱导缺血导致Muller细胞的活化。Muller细胞过量可导致明显的有害后果如黄斑前膜形成、增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）和视网膜神经胶质瘢痕。进一步减少剩余的感光细胞的数量和完整性，并一直外段再生。

 

外段的作用：视紫红质，眼睛中的一种天然色素，并作为视网膜功能的一个标记。它是外段长度和功能的一个敏感指标。对外段恢复有影响。

 

结论：这是一种安全、方便、系统的治疗方法并对缺血/再灌注模型视网膜神经节细胞产生抗凋亡和神经保护作用。我们使用透明质酸钠诱导视网膜脱落模型，叶黄素可以补救RD大鼠的感光细胞。

http://link.springer.com/article/10.1007/s00417-012-2128-z