摘要：背景：进行两个阶段的实验研究确定玻璃体腔内注射伊马替尼（IVI）的最大安全剂量和对大鼠脉络膜新生血管（CNV）的抑制作用。

方法：第一个阶段实验，60只大鼠随机分为六组（A到F），五组动物接受IVI的浓度分别为330（A）、250（B）、165（C）、80（D），和40（E）ug/ 5uL，对照组接收平衡盐溶液（BSS）。除了视网膜电图外，也做了常规的病理分析、胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学。第二阶段实验，对25只大鼠激光光凝诱导CNV，将动物随机分为两组。一组接受在第一阶段确定的IVI的最大安全剂量，另一组均注射BSS。4周后，对两组进行荧光素眼底血管造影荧光素渗漏平均得分和平均CNV区域病理切片比较。

结果：第一阶段实验，ERG显示视网膜毒性为A-D组，而组织病理学显示视网膜毒性为A-C组，因此，40 ug / 5uL的伊马替尼被指定为第二阶段的最大安全剂量。第二阶段实验，晚期荧光素渗漏和CNV面积在伊马替尼治疗眼和对照组之间无显著差异。

结论：尽管使用40ug/ 5uL IVI的安全剂量对激光诱导的CNV无抑制作用。需要进一步的研究来调查伊马替尼同传统抗CNV药物的协同作用。

关键词：伊马替尼 脉络膜新生血管  血小板衍生生长因子 大鼠荧光素血管造影

背景：年龄相关性黄斑变性（AMD）是在65以上，最常见的致盲原因。血管内皮生长因子（VEGF）是在生理和病理血管生成的最重要的细胞因子，导致脉络膜新生血管（CNV）。因此，抗血管内皮生长因子药物是抗血管生成治疗的支柱。血小板衍生生长因子（PDGF）参与血管生成的第二重要的细胞因子，促进招聘细胞、平滑肌细胞是血管成熟和稳定必不可少的因素。PDGF家族结合不同的受体，称为血小板衍生生长因子α和β受体。PDGF受体（PDGFR）是酪氨酸激酶受体，内皮细胞和血管平滑肌细胞中更广泛的表达PDGFR-β。酪氨酸激酶是重要的细胞信号蛋白。多个酪氨酸激酶参与血管生成，包括酪氨酸激酶受体如VEGF和PDGF受体。受体酪氨酸激酶是细胞外信号进入细胞的关键。一些受体酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼，西地尼布，舒尼替尼、帕唑帕尼最近被批准应用。这些药物，通过抑制VEGF和PDGF信号，有望成为CNV治疗的新方法。

甲磺酸伊马替尼是一种酪氨酸激酶的特异性抑制剂，在2001被批准用于治疗人类癌症。它能抑制PDGFR信号转导。在受体信号的情况下，血管周细胞剥离、血管壁的完整性受到损害。血管变得更加敏感，提取血管内皮生长因子，血管衰退变得更为突出。假设伊马替尼能抑制或至少减缓CNV的进展。在第一阶段，在大鼠模型中确定了玻璃体腔注射伊马替尼的最大安全剂量，在第二阶段，在大鼠模型研究了玻璃体腔伊马替尼治疗CNV的可能的抑制作用。

方法：实验设计和动物：研究的目的I期是确定玻璃体腔内注射伊马替尼（IVI）的最大安全剂量和II期确定其可能对CNV动物模型的抑制作用。85只大鼠，体重200-300g。实验猴动物通过肌肉注射氯胺酮麻醉（80mg/kg）和盐酸甲苯噻嗪（（5mg/kg）安乐死。一滴0.5%托吡卡胺扩张瞳孔，在I期ERG和和II期荧光素眼底血管造影后，深度麻醉情况下颈椎脱臼法处死大鼠。

玻璃体腔内注射伊马替尼的制备：伊马替尼仅有100和400mg片剂，并没有任何可注射药剂。药物的活性物质是甲磺酸伊马替尼的形式。甲磺酸伊马替尼在水溶液中的溶解度取决于溶液的pH值和最高的溶解度时pH为5.5-5.8。无菌蒸馏水制备甲磺酸伊马替尼达到pH 5.5-5.8的解决方案是使用少量的硫酸。添加甲磺酸伊马替尼后，最终溶液的pH值为中性。制备40，80，165，250和330u g / 5uL浓度伊马替尼。

第一阶段实验：六十只大鼠随机分为六组（A到F）；其中五组动物右眼接受IVI浓度分别为330（A）、250（B）、165（C）、80（D），和40（E）ug/ 5ul，对照组（F）接受平衡盐溶液（BSS）。注射是在无菌条件下使用手术显微镜进行的，然后在注射后1周和4周，进行视网膜电图（ERG）检查。4周后，处死大鼠，其右眼被摘除进行组织病理学分析。基于ERG和光镜检查结果的基础上，确定第二阶段实验的IVI最大安全剂量。

视网膜电图(ERG)：实验前获得视网膜电图基线值，在注射伊马替尼后1周和4周获得视网膜电图。所有的程序都在黑暗中用红外线照明和图像转换器。简而言之，至少2小时的暗适应后，动物麻醉散瞳。在麻醉期间体温维持在36和37°C之间，然后将动物放置在记录室中一个温度控制的加热垫上。记录ERG信号，实施角膜金丝电极。采用RETI-port /扫描21电生理诊断系统记录ERG信号。同时记录双眼明视、暗视反应。化如果ERG b波振幅变至少从基线值下降30%被认为是重要的。在不同时间点记录ERG结果，并对组间数据进行比较。

组织病理学和免疫组织化学检查：ERG记录后，将动物处死，摘除眼球10%福尔马林固定，5?M组织切片后HE染色光镜下检查。观察视网膜层的完整性和视网膜出血，炎症和萎缩。此外，进行胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的免疫组化研究（多克隆抗胶质纤维酸性蛋白、）组没有任何病理变化。与对照组相比，治疗组视网膜Muller细胞明显增加GFAP免疫反应。组织病理学变化表明视网膜毒性包括：视网膜层不完整性，视网膜出血的存在，和/或炎症、视网膜神经胶质增生或萎缩的存在和GFAP免疫反应存在显著。

第二阶段实验：25只实验性诱发CNV大鼠，分两组，治疗组（14只），右眼玻璃体腔注射第一阶段确定的IVI最大安全剂量，对照组（11只）接受玻璃体腔注射BSS。4周后，动物进行荧光素眼底血管造影（FAG），然后实施安乐死。CNV区域进行组织病理学检查评估。

激光诱导脉络膜新生血管：用大鼠作为激光诱导的CNV动物模型，因为大鼠视网膜同人类视网膜非常相似，着色均匀，光凝后表现出较高的CNV。大鼠麻醉，扩大瞳孔，各眼各主要血管之间应用狭缝灯红外二极管激光传输系统，非接触式78 D镜头，六激光点（波长810 nm；光斑大小，100um；持续时间0.1 s；和功率，150毫瓦）诱导CNV。每一个激光点出现蒸汽气泡预示布玻璃膜的破裂。

荧光素眼底血管造影：激光光凝后四周，进行荧光素眼底血管造影（FAG），在全麻的状态下腹腔注射0.1ml 10%荧光素钠后进行血管造影，视网膜专家对图片进行解释，对晚期强荧光血管造影存在病变分级为：0，无泄漏；1，轻微的泄漏；2，中度泄漏；3、突出的泄漏。

组织病理学切片中脉络膜新生血管区的测量：福尔马林固定眼睛，嵌入石蜡块后，制备薄层切片，苏木精-伊红染色。对CNV病变区连续切片，光镜下观察。使用数码相机拍摄最大的CNV。图像转移到计算机和CNV面积划定并使用ImageJ软件计算。

结果：第一实验阶段：A、C、F中一只大鼠死亡、D组2只大鼠死亡，E组3只动物死亡，被研究排除。

视网膜电图：IVI给药1、4周后，暗适应和明适应的ERG平均振幅，所有组的ERG模式几乎相同。组与组之间，每组在指定的时间点观察的明视ERG结果无显著差异。IVI给药 4周后，暗视ERG的b波平均振幅在A组到D组明显减少，E组和F组没有显著变化。

光学显微镜：组织病理学分析显示，A到C组视网膜毒性的变化视网膜层完整性和视网膜萎缩性改变的形式。D、E组GFAP免疫反应的组织病理学特征与对照组相比不显著。由ERG及病理结果显示：40ug/ 5uL为II期IVI的最大安全剂量。

第二阶段实验：25只大鼠，治疗组3只，对照组1只被最终评价排除。

荧光素血管造影评价脉络膜新生血管：激光应用四周后，FAG激光烧焦的点显示CNV的发展。伊马替尼注入的眼睛的平均得分与对照组没有显著差异。

组织病理学切片中的脉络膜新生血管区：IVI处理的大鼠同对照组相比，脉络膜新生血管区无明显差异，这一发现与FAG的结果是一致的。

讨论：在第一阶段的研究中，40ug/ 5uL IVI被确定为最大安全剂量。为评估兔眼内IVI毒性，kitzmann等人发现在剂量为1.65mg/ 0.1ml伊马替尼能引起家兔广泛的视网膜组织学毒性，而在较低剂量825ug/ 0.1ml和165ug/ 0.1ml时，未见明显毒性反应。

结论：玻璃体腔内注射伊马替尼40ug/ 5uL为最大安全剂量，对模型大鼠CNV无抑制作用。然而，伊马替尼可能在CNV的治疗对常规抗VEGF药物有协同作用，还需要进一步的研究。